S.N. Elansky, L.Yu. Kokaeva, N.V. Statsyuk, Yu.T. Djakov
Predstavitev
Oomycete Phytophthora infestans (Mont.) De Bary - povzročitelj poznega osipa, gospodarsko najpomembnejše bolezni krompirja in paradižnika - že več kot stoletje in pol pritegne pozornost raziskovalcev iz različnih držav. Nenadoma se je sredi XNUMX. stoletja pojavil v Evropi in povzročil epidemijo krompirja, ki je ostala v spominu številnim generacijam.
Do zdaj ga pogosto imenujejo "goba irske lakote". Skoraj sto let po prvih epidemijah so odkrili prostoživeče mehiške vrste krompirja, odporne na pozni plamen, razvili metode križanja z gojenim krompirjem (Muller, 1935) in pridobili prve sorte, odporne proti kasni plesni (Pushkarev, 1937). Kmalu po začetku njihovega komercialnega gojenja pa so se nabrale rase povzročiteljev poznega gripa, ki so bili virulentni do odpornih sort. in uvajanje novih odpornih genov iz divjega mehiškega krompirja v sorte je začelo hitro izgubljati učinkovitost.
Neuspehi z uporabo monogene (vertikalne) odpornosti so prisilili rejce, da so iskali bolj zapletene načine izkoriščanja nespecifične poligenske (horizontalne) odpornosti. V zadnjih letih so se v posameznih populacijah parazita začele kopičiti zelo agresivne rase, kar je povzročilo erozijo celo nespecifične odpornosti. Pojav sevov, odpornih proti fungicidom, je povzročil težave pri uporabi kemikalij za zaščito krompirja.
Zaradi pomembnih razlik med oomiceti in glivami v kemični sestavi, ultrastrukturi in presnovi so fungicidi, zlasti sistemski, ki se uporabljajo za zaščito rastlin pred številnimi glivičnimi boleznimi, proti oomicetom neučinkoviti.
Zato so pri kemijski zaščiti pred nalezljivim opeklinam uporabili večkratno (do 12-krat na sezono ali več) škropljenje s kontaktnimi pripravki širokega spektra delovanja. Revolucionaren korak je bila uporaba fenilamidov, ki so strupeni za oomicete in se sistemsko širijo v rastlinah. Vendar pa je njihova široka uporaba hitro privedla do kopičenja odpornih sevov v populacijah gliv (Davidse in sod., 1981), kar je znatno zapletlo zaščito rastlin. P. infestans je praktično edini parazit zmernega pasu, katerega škode v ekološkem kmetovanju ni mogoče izločiti brez uporabe kemičnih zaščitnih sredstev (Van Bruggen, 1995).
Zgornje pojasnjuje veliko pozornost, ki jo raziskovalci iz različnih držav namenjajo preučevanju populacij P. infestans, dinamiki njihove številčnosti in genetske sestave ter genetskim mehanizmom variabilnosti.
Življenjski cikel R. INFESTANS
Oomycete Phytophthora infestans razvije medcelični micelij s haustorijo znotraj krompirjevih listov. Hrani se na listnih tkivih in povzroča nastanek temnih lis, ki v mokrem vremenu pocrnijo in zgnijejo. Z močnim porazom odmre celoten list. Po obdobju hranjenja na miceliju nastanejo izrastki - sporangioforji -, ki rastejo navzven skozi ožilje. V mokrem vremenu tvorijo bel cvet okoli lis na spodnji strani listov. Na koncih sporangioforjev nastanejo zoosporangije v obliki limone, ki se odlomijo in jih prenaša pršenje dežja (slika 1). Spadajo v kapljice vode na površini krompirjevih listov, kalijo sporangije s 6-8 zoosporami, ki so po obdobju gibanja zaokrožene, prekrite z membrano in kalijo z zarodnimi cevkami. Kalček prodira skozi stomate v listno tkivo. Pod določenimi pogoji lahko sporangije zrastejo v rastni cevi neposredno v listno tkivo. V ugodnih pogojih je čas od okužbe do nastanka nove sporulacije le 3-4 dni.
Ko so sporangije na tleh in filtrirane skozi tla, lahko okužijo gomolje. Močno prizadeti gomolji med skladiščenjem gnijejo; pri šibko prizadetih lahko okužba traja do naslednje sezone. Poleg tega lahko povzročitelj poznega plina ostane v zimskem času v obliki oospor (debelostenskih počivajočih spolnih spor) v tleh na rastlinskih ostankih in na paradižnikovih semenih. Oospore nastajajo na živih organih rastlin, ko se sevi različnih vrst parjenja srečajo s prekomerno vlago. Spomladi na zasajenih okuženih gomoljih in na rastlinskih ostankih z oosporami nastane nespolna sporulacija; zoospore vstopijo v tla in povzročijo okužbo spodnjih listov rastlin. V nekaterih primerih lahko micelij zraste iz okuženega gomolja vzdolž zelenega dela rastline in se običajno pojavi v zgornjem delu stebla.
Pomembna razlika med oomiceti in večino gliv je v prevladi diplofaze v njihovem življenjskem ciklu z gametno mejozo in kalitvijo zigot (oospor) brez reduktivne jedrske cepitve. Zdi se, da ta lastnost, skupaj z dipolarnim heterotalizmom, ki nadomešča biseksualnost, omogoča uporabo oomicetov pristopov, razvitih za proučevanje populacij višjih evkariontov (analiza panmiksije in razdeljevanja populacij, intra- in interpopulacijski tokovi genov itd.). Vendar pa trije dejavniki ne omogočajo popolnega prenosa teh pristopov pri preučevanju populacij P. infestans.
1. Skupaj s hibridnimi oosporami se v populacijah tvorijo samoplodne in partenogenetske oospore (Fife in Shaw, 1992; Anikina et al., 1997a; Savenkova, Cherepnikoba-Anirina, 2002; Smirnov, 2003) in pogostost njihovega nastanka lahko zadostuje za vpliv na rezultate testa.
2. Spolni proces pri P. infestans nepomembno prispeva k dinamiki velikosti populacije, ker se glive razmnožujejo predvsem z vegetativnimi spori, ki tvorijo več kot 90% rezultatov analize vrste parjenja po tradicionalni metodi na hranilnem mediju ... rastna sezona več generacij nespolne sporulacije (razvoj policiklične bolezni). Oospore imajo pomembno vlogo pri ohranjanju organizma v obdobju, ko ni zelenih rastlin (pozimi) in pri primarni okužbi sadik. Nato poleti pride do razmnoževanja klonov in povečanja ali, nasprotno, zmanjšanja števila posameznih klonov, ki so nastali kot posledica spolne rekombinacije, kar je v glavnem določeno z izbiro bolj prilagojenih. Zato je lahko razmerje med posameznimi kloni v populaciji na začetku in koncu epifitotike popolnoma drugačno.
3. Opisani cikel je značilen za avtohtone populacije P. infestans v njihovi domovini, Srednji Ameriki. Na drugih delih sveta spolni proces ni bil znan več kot 100 let; vegetativni micelij v okuženih gomoljih krompirja je bil prezimovanje. Življenjski cikel je bil popolnoma agamičen, širjenje pa je bilo osrednje: okužba iz posameznih okuženih posajenih gomoljev je prešla na liste in tvorila primarna žarišča bolezni, ki so se lahko združila med množičnim razvojem bolezni.
Tako lahko v nekaterih regijah pride do izmenjave spolnih in nespolnih ciklov, v drugih pa le nespolni cikel.
Izvor P. INFESTANS
P. infestans so se v Evropi pojavili konec prve polovice 1991. stoletja. Ker je krompir doma iz severovzhodnega dela Južne Amerike, so domnevali, da je bil parazit od tam pripeljan v Evropo v času razcveta čilske selitre. Vendar pa so študije, opravljene na krompirjevi postaji Rockefeller Center v dolini Toluca v Mehiki, prisilile k ponovni preučitvi tega stališča (Niederhauser, 1993, XNUMX).
1. V dolini Toluke imajo lokalne gomoljaste vrste krompirja (Solanum demissum, S. bulbocastanum itd.) Različne sklope genov za vertikalno odpornost v kombinaciji z visoko stopnjo nespecifične odpornosti, kar kaže na dolgotrajno sorazvoj s parazitom. Južnoameriškim vrstam, vključno s pridelkom krompirja, primanjkuje genov odpornosti.
2. V dolini Toluce najdemo izolate s tipi parjenja A1 in A2, zaradi česar je zelo razširjena pasemska populacija P. infestans; medtem ko se v avtohtoni deželi gojenega krompirja, Južni Ameriki, parazit širi klonsko.
3. V dolini Toluce so vsako leto hude epidemije poznega plina. Zato je med severnoameriškimi raziskovalci (Univerza Cornell) uveljavljeno mnenje o Mesoameriki (Srednja Amerika) kot rojstnem kraju krompirjeve fitoftore (Goodwin in sod., 1994).
Južnoameriški raziskovalci se tega mnenja ne strinjajo. Menijo, da imata gojeni krompir in njegov parazit P. infestans skupno domovino - južnoameriške Ande. Svoje stališče so podprli z molekularnimi študijami o analizi polimorfizmov DNA mitohondrijskega genoma (mtDNA) in jedrskih genov RAS in β-tubulina (Gomez-Alpizar et al., 2007). Pokazali so, da sevi, zbrani z različnih delov sveta, izvirajo iz treh različnih vrst prednikov, ki (vse tri) najdemo v južnoameriških Andih. Andski haplotipi so potomci dveh linij: izolati najstarejšega rodu mtDNA so na divjih solanaceah iz odseka Anarrhicomenum v Ekvadorju, izolati druge vrstice pa so pogosti na krompirju, paradižniku in divjih nočnih sencah. V Toluci celo redki haplotipi izvirajo iz samo ene linije, genetska variabilnost sevov Toluca (nizka alelna frekvenca nekaterih spremenljivih mest) kaže na močan učinek ustanovitelja zaradi nedavnega odnašanja.
Poleg tega je bila v Andih najdena nova vrsta P. andina, ki je morfološko in genetsko podobna P. infestans, kar po mnenju avtorjev kaže na Ande kot vročo točko speciacije v rodu Phytophthora. Nazadnje v Evropi in ZDA populacije P. Infestans vključujejo obe andski lozi, v Toluci pa le eno.
Ta publikacija je sprožila odziv skupine raziskovalcev iz različnih držav, ki so opravili veliko eksperimentalnih del za revizijo prejšnje študije (Goss in sod., 2014). V tem delu so najprej za proučevanje polimorfizmov DNA uporabili bolj informativne mikrosatelitske sekvence DNA; drugič, za analizo grozdov, migracijskih poti, časa razhajanja populacij itd. uporabljeni so bili naprednejši modeli (F-statistika, Bayesov približek itd.), tretjič pa je bila uporabljena primerjava ne le z andsko vrsto P. andina, v kateri je bila vzpostavljena hibridna narava (P. infestans x Phytophthora sp.) , pa tudi z mehiškimi endemičnimi vrstami P. mirabilis, P. Ipomoeae in Phytophthora phaseoli - genetsko blizu P. infestans, ki pripadajo isti kladi (Kroon et al., 2012). Kot rezultat teh analiz je bilo nedvoumno dokazano, da koreninski del filogenetskega drevesa vseh vrst rodu Phytophthora, vključenih v študijo, razen hibrida P. andina, pripada mehiškim sevom, migracijski tok pa ima smer Mehika - Andi in ne obratno, njegov začetek pa sovpada z evropskim kolonizacija novega sveta (pred 300-600 leti). Tako se je pojav vrste P. infestans, specializirane za poraz krompirja, zgodil v sekundarnem genetskem središču nastanka gomoljnih nočnih pastirjev, tj. v Srednji Ameriki.
Genom P. INFESTANS
Leta 2009 je mednarodna skupina znanstvenikov sekvencirala celoten genom P infestans (Haas et al, 2009), katerega velikost je bila 240 MB. To je nekajkrat več kot pri sorodnih vrstah P. sojae (95 Mb), ki povzročajo gnitje korenin soje in P. Ramorum (65 Mb), ki prizadene tako dragocene drevesne vrste, kot so hrast, bukev in nekatere druge. Pridobljeni podatki so pokazali, da genom vsebuje veliko število kopij ponovljenih zaporedij - 74%. Genom vsebuje 17797 genov, ki kodirajo beljakovine, med katerimi so večinoma geni, ki sodelujejo v celičnih procesih, vključno z replikacijo DNA, transkripcijo in translacijo proteinov.
Primerjava genov rodu Phytophthora je razkrila nenavadno organizacijo genoma, sestavljeno iz blokov zaporedij ohranjenih genov, pri katerih je genska gostota razmeroma visoka, vsebnost ponavljajočih se zaporedij pa sorazmerno nizka in posamezne regije z neohranjenimi genskimi zaporedji z nizko gostoto genov in veliko vsebnostjo ponavljajočih se regij. Konzervativni bloki predstavljajo 70% (12440) vseh genov, ki kodirajo beljakovine P. infestans. Znotraj konzervativnih blokov so geni navadno na tesni razdalji s povprečno intergeno razdaljo 604 bp. Na območjih med konzervativnimi bloki je medgenerativna razdalja večja (3700 bp) zaradi povečanja gostote ponavljajočih se elementov. Hitro razvijajoči se sekretorni geni se nahajajo v gensko revnih regijah.
Analiza zaporedja genoma P. Infestans je pokazala, da približno tretjina genoma pripada prenosljivim elementom. Genom P. infestans vsebuje bistveno več različnih družin transpozonov kot drugi znani genomi. Večina transpozonov P. infestans pripada družini Gypsy.
V genomu P. infestans je bilo ugotovljeno veliko število specifičnih genskih družin, ki sodelujejo v patogenezi. Pomemben del jih kodira efektorske beljakovine, ki spreminjajo fiziologijo gostiteljske rastline in prispevajo k njeni okužbi. Spadajo v dve široki kategoriji: apoplastični efektorji, ki delujejo v medceličnih prostorih (apoplasti), in citoplazemski efektorji, ki vstopijo v celice preko haustorije. Apoplastični efektorji vključujejo izločene hidrolitične encime, kot so proteaze, lipaze in glikozilaze, ki uničujejo rastlinske celice; zaviralci obrambnih encimov gostiteljskih rastlin in nekrotizirajoči toksini, kot so Nep1 podobni proteini (NPL) in Pcf podobni majhni beljakovine, bogate s cisteinom (SCR).
Učinkoviti geni P. infestans so številni in običajno večji od nepatogenih genov. Najbolj znana sta citoplazemska efektorja RXLR in Crinkler (CNR). Tipični citoplazemski efektorji oomicetov so proteini RXLR. Vsi doslej odkriti efektorski geni RXLR vsebujejo amino-terminalno skupino Arg-XLeu-Arg, kjer je X aminokislina. Kot rezultat študije je bilo predlagano, da je v genomu P. infestans 563 genov RXLR, kar je 60% več kot pri P. sojae in P. ramorum. Približno polovica genov RXLR v genomu P. infestans je specifična za vrsto. RFLR efektorji imajo najrazličnejša zaporedja. Med njimi je bila identificirana ena velika in 150 majhnih družin. Za razliko od glavnega proteoma se efektorski geni RXLR običajno nahajajo v regijah genoma, ki so revne in ponavljajoče se. Mobilni elementi, ki določajo dinamičnost teh regij, olajšajo rekombinacijo teh genov.
Citoplazemski CRN efektorji so bili prvotno identificirani v prepisih P. infestans, ki kodirajo peptide nekroze rastlinskega tkiva. Od njihovega odkritja je bilo o družini teh efektorjev malo znanega. Analiza genoma P. Infestans je razkrila ogromno družino 196 genov CRN, ki je bistveno večja kot pri P. sojae (100 CRN) in P. ramorum (19 CRN). Tako kot RXLR so tudi CRN modularni proteini in so sestavljeni iz visoko konzervirane N-terminalne domene LFLAK (50 aminokislin) in sosednje domene DWL, ki vsebuje različne gene. Večina CRN (60%) ima signalni peptid.
Proučena je bila možnost različnih CRN-jev, da motijo celične procese gostiteljske rastline. Pri analizi rastlinske nekroze je odstranitev proteinov CRN2 omogočila identifikacijo C-terminalne regije, ki je sestavljena iz 234 aminokislin (položaji 173-407, domena DXG) in povzroča celično smrt. Analiza genov P. infestans CRN je pokazala štiri različne C-terminalne regije, ki povzročajo tudi celično smrt v rastlini. Sem spadajo na novo identificirane DC domene (P. Infestans ima 18 genov in 49 psevdogenov), pa tudi domeni D2 (14 in 43) in DBF (2 in 1), ki so podobne protein kinazam. Beljakovine CRN domen, izražene v rastlini, se ohranijo (v odsotnosti signalnih peptidov) v rastlinski celici in spodbujajo celično smrt z znotrajceličnim mehanizmom. Drugih 255 zaporedij, ki vsebujejo domene CRN, najverjetneje ne deluje kot geni.
Povečanje števila in velikosti družin efektorskih genov RXLR in CRN je verjetno posledica nealelne homologne rekombinacije in podvajanja genov. Kljub dejstvu, da genom vsebuje veliko število aktivnih mobilnih elementov, še vedno ni neposrednih dokazov o prenosu efektorskih genov.
Metode, uporabljene pri proučevanju strukture prebivalstva
Študija genske strukture populacij trenutno temelji na analizi čistih kultur sestavnih sevov. Analiza populacij brez izolacije čistih pridelkov se izvaja tudi za posebne namene, kot je na primer preučevanje agresivnosti populacije ali prisotnosti sevov, odpornih proti fungicidom, v njej (Filippov idr., 2004; Derevyagina idr., 1999). Ta vrsta raziskav vključuje uporabo posebnih metod, katerih opis presega obseg tega pregleda. Za primerjalno analizo sevov se uporabljajo številne metode, ki temeljijo tako na analizi strukture DNA kot na proučevanju fenotipskih manifestacij. Primerjalna analiza populacij se mora spoprijeti z velikim številom izolatov, kar nalaga določene zahteve uporabljenim metodam. V idealnem primeru bi morali izpolnjevati naslednje zahteve (Cooke, Lees, 2004, Mueller, Wolfenbarger, 1999):
- biti poceni, enostavni za uporabo, ne zahtevajo večjih časovnih izdatkov, temeljiti morajo na splošno dostopnih tehnologijah (na primer PCR);
- ustvariti mora dovolj veliko število neodvisnih kodominantnih označevalnih lastnosti;
- imajo visoko obnovljivost;
- uporabite najmanjšo količino tkiva za pregled;
- biti specifičen za substrat (onesnaženje v kulturi ne sme vplivati na rezultate);
- ne zahtevajo uporabe nevarnih postopkov in zelo strupenih kemikalij.
Na žalost ni nobenih metod, ki bi ustrezale vsem zgornjim parametrom. Za primerjalno študijo sevov v našem času se uporabljajo metode, ki temeljijo na analizi fenotipskih lastnosti: virulenca do sort krompirja in paradižnika (rase krompirja in paradižnika), vrsta parjenja, spektri izoencimov peptidaze in glukoza-6-fosfat izomeraze ter na analizi strukture DNA: polimorfizem dolžine restrikcijski fragment (RFLP), ki ga običajno dopolnimo s hibridizacijsko sondo RG 57, analizo mikrosatelitskih ponovitev (SSR in InterSSR), ojačanje z naključnimi primerji (RAPD), ojačanje restrikcijskih fragmentov (AFLP), ojačanje s primerji, homolognimi zaporedjem mobilnih elementov (na primer Inter SINE PCR), določanje haplotipov mitohondrijske DNA.
Kratek opis metod za primerjalno preučevanje sevov, uporabljenih pri delu s P. Infestans
Fenotipske lastnosti označevalcev
Dirke po "krompirju"
Krompirjeve rase so pogosto raziskane in uporabljene oznake. "Preproste krompirjeve" rase imajo en gen za virulenco krompirja, "kompleksne" pa vsaj dva. Black et al. (1953) so na podlagi povzetka vseh podatkov, ki so jim na voljo, ugotovili, da je rasa fitoftorov sposobna okužiti rastline z odpornimi geni / geni, ki ustrezajo genom / genom virulence P. infestans, in ugotovili ras 1, 2, 3 in 4, ki okužijo rastline z geni R1, R2, R3 oziroma R4, tj. interakcija med parazitom in gostiteljem poteka v skladu z genskim načelom. Nadalje je Black s sodelovanjem Galleglyja in Malcolmsona odkril odporne gene R5, R6, R7, R8, R9, R10 in R11 ter ustrezne rase (Black, 1954; Black & Gallegly, 1957; Malcolmson & Black, 1966; Malcolmson, 1970).
Obstaja obsežen nabor podatkov o rasni sestavi patogena iz različnih regij. Ne da bi podrobno analizirali te podatke, bomo navedli le splošen trend: tam, kjer so bile uporabljene sorte z novimi geni odpornosti ali njihovimi kombinacijami, je najprej prišlo do oslabitve poznega plamenjača, nato pa so se pojavile dirke z ustreznimi virulenčnimi geni, ki so se nadaljevale in izbruhi poznega plamenjača so se nadaljevali. V zbirkah, zbranih pred uvedbo v gojenje sort s temi geni, so redko opazili specifično virulenco proti prvim 4 rezistentnim genom (R1-R4), vendar se je število virulentnih sevov strmo povečalo, ko je patogen parazitiral na sortah, ki nosijo te gene. Po drugi strani pa so bili geni 5–11 precej pogosti v zbirkah (Shaw, 1991).
Študija razmerja različnih ras v rastni sezoni, izvedena konec osemdesetih let, je pokazala, da na začetku razvoja bolezni v populaciji prevladujejo kloni z nizko agresivnostjo in 1980-1 virulenčnimi geni.
Poleg tega se z razvojem poznega plina koncentracija prvotnih klonov zmanjša in število "kompleksnih" ras z visoko agresivnostjo narašča. Pojav slednjih do konca sezone doseže 100%. Pri shranjevanju gomoljev pride do zmanjšanja agresivnosti in izgube posameznih genov virulence. Dinamika nadomeščanja klonov se lahko pri različnih sortah pojavlja na različne načine (Rybakova in Dyakov, 1990). Vendar so naše študije v letih 2000–2010 pokazale, da najdemo zapletene rase že od samega začetka epifitotikov med sevi, izoliranimi iz krompirja in paradižnika. Verjetno je to posledica sprememb populacije P. Infestans v Rusiji.
Do 1988-1995 je pogostnost pojavljanja "superras" z vsemi ali skoraj vsemi virulenčnimi geni v različnih regijah dosegla 70-100%. Takšno stanje so opazili na primer v Belorusiji, Leningradu, Moskovski regiji, Severni Osetiji in Nemčiji (Ivanyuk et al., 2002a, 2002b; Politiko, 1994; Schober-Butin et al., 1995).
Dirke "paradižnik"
V sortah paradižnika sta bila odkrita le 2 gena odpornosti na pozno pegavost - Ph1 (Gallegly & Marvell, 1955) in Ph2 (Al-Kherb, 1988). Tako kot pri krompirjevih rasah se tudi med paradižniki in P. infestansom interakcija pojavlja na osnovi genov. Rasa T0 okuži sorte, ki nimajo genov odpornosti (večina industrijsko uporabljenih sort), rasa T1 okuži sorte z genom Ph1 (Ottawa), rasa T2 pa sorte z genom Ph2.
V Rusiji so na krompirju našli skoraj izključno T0; Na paradižniku je na začetku sezone prevladoval T0, pozneje pa ga je nadomestila dirka T1 (Dyakov idr., 1975, 1994). Po letu 2000 se je T1 na krompirju v številnih populacijah začel pojavljati na samem začetku epifitoznega obdobja. V Združenih državah Amerike so bili krompirjevi sevi nepatogeni za paradižnik, pa tudi rase T0, T1 in T2, medtem ko sta na paradižniku prevladovali T1 in T2 (Vartanian & Endo, 1985; Goodwin in sod., 1995).
Vrsta parjenja
Za izvedbo študije so potrebni preskusni (referenčni) sevi z znanimi vrstami parjenja - A1 in A2. Preskusni izolat se z njimi v parih cepi v petrijevke z medijem ovsenega agarja. Po inkubaciji 10 dni se plošče pregledajo na prisotnost ali odsotnost oospor v mediju v kontaktnem območju sevov. Obstajajo 4 možnosti: sev spada v vrsto parjenja A1, če tvori oospore s preizkuševalcem A2, v A2, če tvori oospore s testerjem A1, v A1A2, če tvori oospore z obema preizkuševalcema ali je sterilen (00), če ne tvori oospor brez preizkuševalca (zadnji dve skupini sta redki).
Da bi hitreje določili vrste parjenja, so poskušali identificirati regije genoma, povezane s tipom parjenja, z namenom njihove nadaljnje uporabe za določanje vrste parjenja s PCR. Ameriški raziskovalci so izvedli enega prvih uspešnih poskusov za identifikacijo takšnega območja (Judelson et al., 1995). Z metodo RAPD so uspeli identificirati območje W16, povezano s tipom parjenja, pri potomcih dveh križanih izolatov in oblikovali par 24-bp primerjev za njegovo ojačanje (W16-1 (5'-AACACGCACAAGGCATATAAATGTA-3 ') in W16-2 (5' -GCGTAATGTAGCGTAACAGCTCTC-3 ') Po restrikciji produkta PCR z restrikcijskim encimom HaeIII je bilo mogoče izolate ločiti s seznama tipov A1 in A2.
Korejski raziskovalci so poskušali pridobiti PCR markerje za določitev vrst parjenja (Kim, Lee, 2002). Z metodo AFLP so identificirali določene izdelke. Kot rezultat je bil razvit par začetnic PHYB-1 (naprej) (5'-GATCGGATTAGTCAGACGAG-3 ') in PHYB-2 (5'-GCGTCTGCAAGGCGCATTTT-3'), ki omogoča selektivno ojačanje genomske regije, povezane z vrsto parjenja A2. Nato so nadaljevali s tem delom in oblikovali primerje 5 'AAGCTATACTGGGACAGGGT-3' (INF-1, naprej) in 5'-GCGTTCTTTCGTATTACCAC-3 '(INF-2), ki omogoča selektivno ojačanje regije Mat-A1, značilno za seve z vrsto parjenja. A1. Uporaba PCR diagnostike tipov parjenja je pokazala dobre rezultate pri proučevanju populacij P. infestans na Češkem (Mazakova in sod., 2006), Tuniziji (Jmour, Hamada, 2006) in drugih regijah. V našem laboratoriju (Mytsa, Elansky, neobjavljeno) je bilo analiziranih 34 sevov P. infestans, izoliranih iz obolelih organov krompirja in paradižnika v različnih regijah Rusije (Kostroma, Rjazan, Astrahan in Moskva). Rezultati analize PCR z uporabo posebnih primerjev so več kot 90% sovpadali z rezultati analize vrste parjenja po tradicionalni metodi na hranilnem mediju.
Tabela 1. Variabilnost odpornosti znotraj klona Sib 1 (Elansky et al., 2001)
Mesto zbiranja vzorcev | Število analiziranih izolatov | Število občutljivih (S), šibko odpornih (SR) in odpornih (R) sevov, kosov (%) | ||
S | SR | R | ||
G. Vladivostok | 10 | 1 (10) | 4 (40) | 5 (50) |
G. Chita | 5 | 0 | 0 | 5 (100) |
Irkutsk | 9 | 9 (100) | 0 | 0 |
G. Krasnojarsk | 13 | 12 (92) | 1 (8) | 0 |
Mesto Jekaterinburg | 15 | 8 (53) | 1 (7) | 6 (40) |
O. Sahalin | 66 | 0 | 0 | 66 (100) |
Regija Omsk | 18 | 0 | 0 | 18 (100) |
Odpornost na metalaksil kot populacijski marker
V zgodnjih osemdesetih letih prejšnjega stoletja so v različnih regijah opazili močne izbruhe poznega krompirja, ki so jih povzročili sevi P. infestans, odporni na metalaksil. Krompirjeve farme v mnogih državah so utrpele velike izgube (Dowley in O'Sullivan, 1980; Davidse in sod., 1981; Derevyagina, 1983). Od takrat se v mnogih državah sveta izvaja stalno spremljanje pojavljanja sevov, odpornih proti fenilamidu, v populacijah P. infestans. Poleg praktične ocene možnosti za uporabo zdravil, ki vsebujejo fenilamid, oblikovanja sistema zaščitnih ukrepov in napovedovanja epifitotij, je odpornost na ta zdravila postala ena od značilnosti, ki se pogosto uporablja za primerjalno analizo populacij tega patogena. Vendar je treba v primerjalnih populacijskih študijah uporabiti odpornost na metalaksil, pri čemer je treba upoštevati dejstvo, da: 1991 - genetska osnova odpornosti še ni natančno določena, 1 - odpornost na metalaksil je selektivno odvisna lastnost, ki se lahko razlikuje glede na uporabo fenilamidov, 2 - drugačna stopnja občutljivosti na seve metalaksil znotraj ene klonske črte (tabela 3).
Spektri izocimov
Izocimski označevalci so običajno neodvisni od zunanjih pogojev, kažejo mendelovsko dedovanje in so kodominantni, kar omogoča razlikovanje med homo- in heterozigoti. Uporaba beljakovin kot genskih označevalcev omogoča prepoznavanje tako velikih reorganizacij genskega materiala, vključno s kromosomskimi in genomskimi mutacijami, kot posameznih aminokislinskih zamenjav.
Elektroforetske študije proteinov so pokazale, da večina encimov obstaja v organizmih v obliki več frakcij, ki se razlikujejo po elektroforetski gibljivosti. Te frakcije so rezultat kodiranja več oblik encimov z različnimi lokusi (izocimi ali izocimi) ali različnimi aleli istega lokusa (alocimi ali aloencimi). To pomeni, da so izocimi različne oblike enega encima. Različne oblike imajo enako katalitično aktivnost, vendar se nekoliko razlikujejo po posameznih aminokislinskih nadomestkih v peptidu in v naboju. Takšne razlike se pokažejo med elektroforezo.
Pri preučevanju sevov P. infestans se uporabljajo spektri izoencimov dveh beljakovin, peptidaze in glukoza-6-fosfat izomeraze (ta encim je v ruskih populacijah monomorfen, zato metode tega proučevanja v tem delu niso predstavljene). Da jih ločimo na izoencime v električnem polju, beljakovinske pripravke, izolirane iz preučevanih organizmov, nanesemo na gelsko ploščo, postavljeno v električno polje. Hitrost difuzije posameznih beljakovin v gelu je odvisna od naboja in molekulske mase, zato se v električnem polju mešanica beljakovin loči v posamezne frakcije, ki jih je mogoče vizualizirati s posebnimi barvili.
Študija izoencimov peptidaze se izvaja na celulozno-acetatnih, škrobnih ali poliakrilamidnih gelih. Najbolj priročna je metoda, ki temelji na uporabi celuloznih acetatnih gelov, ki jih proizvaja Helena Laboratories Inc. Ne zahteva velikih količin preskusnih materialov, omogoča pridobitev kontrastnih trakov na gelu po elektroforezi za oba encimska lokusa, njegovo izvajanje ne zahteva velikih časovnih in materialnih stroškov (slika 2).
Majhen košček micelija se prenese v 1,5-mililitrsko mikrocevko, ki ji dodamo 1-2 kapljici destilirane vode. Po tem se vzorec homogenizira (na primer z električnim vrtalnikom s plastičnim nastavkom, primernim za mikrocevko) in sedimentira 25 sekund na centrifugi pri 13000 vrt / min. 8 μl iz vsake mikrocevke. supernatant se prenese na aplikatorsko ploščo.
Celulozni acetatni gel odstranimo iz puferske posode, popivamo med dvema listoma filtrirnega papirja in položimo z delovno plastjo navzgor na plastično podlago aplikatorja. Raztopino s plošče aplikator 2-4 krat prenese na gel. Gel se prenese v komoro za elektroforezo,
Tabela 2. Sestava raztopine, ki se uporablja za obarvanje celuloznega acetatnega gela pri analizi izoencimov peptidaze, na rob gela položimo kapljico barve (bromofenolsko modra).
TRIS HCl, 0,05 M, Ph 8,0 2 ml
Peroksidaza, 1000 enot / ml 5 kapljic
o-dianisidin, 4 mg / ml 8 kapljic
MgCl2, 20 mg / ml 2 kapljici
Gly-Leu, 15 mg / ml 10 kapljic
L-aminokislinska oksidaza, 20 u / ml 2 kapljici
Elektroforeza se izvaja 20 minut. pri 200 V. Po elektroforezi se gel prenese na slikarsko mizo in obarva s posebno raztopino za barvanje (tabela 2). 10 ml 1,6% DIFCO agarja predhodno stopimo v mikrovalovni pečici, ohladimo na 60 ° C, nato pa 2 ml agarja zmešamo z mešanico barv in zlijemo na gel. Proge se pojavijo v 15-20 minutah. Reagent L-aminokislinske oksidaze dodamo tik pred mešanjem raztopine s staljenim agarjem.
V ruskih populacijah lokus Pep 1 predstavljajo genotipi 100/100 in 92/100. Homozigot 92/92 je izjemno redek (približno 0,1%). Locus Rehr 2 predstavljajo trije genotipi 100/100, 100/112 in 112/112, vse tri različice pa so precej pogoste (Elanky in Smirnov, 3, slika 2003).
Raziskovanje genoma
Polimorfizem dolžine omejenega fragmenta s poznejšo hibridizacijo (RFLP-RG 57)
Celotno DNA obdelamo z restrikcijskim encimom Eco R1, fragmente DNA ločimo z elektroforezo v agaroznem gelu. Jedrska DNA je zelo velika in ima veliko ponavljajočih se zaporedij, kar otežuje neposredno analizo številnih fragmentov, dobljenih z delovanjem restrikcijskih encimov. Zato se fragmenti DNA, ločeni v gelu, prenesejo v posebno membrano in uporabijo za hibridizacijo s sondo RG 57, ki vključuje nukleotide, označene z radioaktivnimi ali fluorescenčnimi nalepkami. Ta sonda hibridizira s ponavljajočimi se genomskimi sekvencami (Goodwin in sod., 1992, Forbes in sod., 1998). Po vizualizaciji rezultatov hibridizacije na svetlobnem ali radioaktivnem materialu dobimo multilokusni hibridizacijski profil (odvzem prstnih odtisov), ki ga predstavlja 25-29 fragmentov (Forbes in sod., 1998). Nespolni (klonski) potomci bodo imeli enake profile. Po razporeditvi pasov na elektroforetogramu lahko presodimo podobnosti in razlike primerjanih organizmov.
Haplotipi mitohondrijske DNA
V večini evkariontskih celic je mtDNA predstavljena v obliki dvoverižne krožne molekule DNA, ki se za razliko od jedrskih kromosomov evkariontskih celic polkonzervativno replicira in ni povezana z beljakovinskimi molekulami.
Mitohondrijski genom P. infestans je bil zaporeden in številna dela so bila posvečena analizi dolžin restrikcijskih fragmentov (Carter in sod., 1990, Goodwin, 1991, Gavino, Fry, 2002). Potem ko sta Griffith in Shaw (1998) razvila preprosto in hitro metodo za določanje haplotipov mtDNA, je ta marker postal eden najbolj priljubljenih v študijah P. Infestansa, bistvo metode pa je zaporedno ojačanje dveh fragmentov mitohondrijske DNA (iz skupnega genoma) s primerji F2-R2 in F4-R4 (tabela 3) in njihova nadaljnja restrikcija z restrikcijskimi encimi MspI (1. fragment) in EcoR1 (2. fragment). Metoda vam omogoča prepoznavanje 4 haplotipov: Ia, IIa, Ib, IIb. Tip II se od tipa I razlikuje po prisotnosti vložka velikosti 1881 bp in po drugačni lokaciji restrikcijskih mest v regijah P2 in P4 (slika 3).
Od leta 1996 so bili med sevi, zbranimi na ozemlju Rusije, le haplotipa Ia in IIa (Elansky et al., 2001, 2015). Lahko jih prepoznamo po ločitvi produktov omejevanja s temeljnim premazom F2-R2 v električnem polju (slike 4, 5). Vrste mtDNA se uporabljajo pri primerjalni analizi sevov in populacij. V številnih študijah so vrste mitohondrijske DNA uporabljali za izolacijo klonskih linij in pasportizacijo izolatov P. infestans (Botez in sod., 2007; Shein in sod., 2009). Z uporabo metode PCR-RFLP je bilo ugotovljeno, da je mtDNA heterogena v istem sevu P. infestans (Elansky in Milyutina, 2007). Pogoji ojačanja: 1x (500 sek. 94 ° C), 40x (30 sek. 90 ° C, 30 sek. 52 ° C, 90 sek. 72 ° C); 1x (5 min. 72 ° C). Reakcijska zmes: (20 μl): 0,2 U Taq DNA polimeraze, 1x 2,5 mM pufra MgCl2-Taq, 0,2 mM vsak dNTP, 30 pM primerja in 5 ng analizirane DNA, deionizirana voda - do 20 μl.
Omejitev produkta PCR se izvaja 4-6 ur pri temperaturi 37 ° C. Restrikcijska mešanica (20 μl): 10x MspI (2 μl), 10x restrikcijski pufer (2 μl), deionizirana voda (6 μl), produkt PCR (10 μl).
Tabela 3. Primeri, ki se uporabljajo za pomnoževanje polimorfnih regij mtDNA
Locus | Primer | Dolžina in postavitev temeljnega premaza | Dolžina izdelka PCR | Restriktaza |
---|---|---|---|---|
P2 | F2: 5'- TTCCCTTTGTCCTCTACCGAT | 21; 13619-13639 | 1070 | MspI |
R2: 5'- TTACGGCGGTTTAGCACATACA | 22; 14688-14667 | |||
P4 | F4: 5'- TGGTCATCCAGAGGTTTATGTT | 22; 9329-9350 | 964 | EcoRI |
R4:5 - CCGATACCGATACCAGCACCAA | 22; 10292-10271 |
Naključno ojačanje temeljnega premaza (RAPD)
Pri izvajanju RAPD se uporablja en primer (včasih več primerov hkrati) s poljubnim nukleotidnim zaporedjem, običajno dolgim 10 nukleotidov, z visoko vsebnostjo (od 50%) GC nukleotidov in nizko temperaturo žarjenja (približno 35 ° C). Takšni primerki "pristanejo" na številnih komplementarnih mestih v genomu. Po ojačitvi dobimo veliko število amplikonov. Njihovo število je odvisno od uporabljenega (-ih) osnovnega (-ih) osnovnega (-ih) in reakcijskih pogojev (koncentracija MgCl2 in temperatura žarjenja).
Vizualizacija amplikonov se izvede z destilacijo v poliakrilamidu ali agaroznem gelu. Pri izvajanju RAPD analize je treba skrbno spremljati čistost analiziranega materiala, ker kontaminacija z drugimi živimi predmeti lahko povzroči znatno povečanje števila artefaktov, ki so pri analizi čistega materiala precej številni (Perez et al, 1998). Uporaba te metode pri preučevanju genoma P. infestans se odraža v številnih delih (Judelson, Roberts, 1999, Ghimire et al., 2002, Carlisle et al., 2001). Izbor reakcijskih pogojev in primerjev (preučevali smo 51 primerkov z 10 nukleotidi) so v članku podali Abu-El Samen et al., (2003).
Analiza mikrosatelitskih ponovitev (SSR)
Mikrosatelitske ponovitve (preproste ponovitve zaporedja, SSR) so tandemsko ponovljene kratke sekvence 1-3 (včasih do 6) nukleotidov, prisotnih v jedrskih genomih vseh evkariontov. Število zaporednih ponovitev se lahko razlikuje od 10 do 100. Mikrosatelitski lokusi se pojavljajo s precej visoko frekvenco in so bolj ali manj enakomerno porazdeljeni po celotnem genomu (Lagercrantz et al., 1993). Polimorfizem mikrosatelitskih zaporedij je povezan z razlikami v številu ponovitev osnovnega motiva. Mikrosatelitski označevalci so soprevladujoči, kar omogoča njihovo uporabo za analizo populacijske strukture, določanje sorodstva, migracijskih poti genotipa itd. Med drugimi prednostmi teh markerjev je treba opozoriti na njihov visok polimorfizem, dobro obnovljivost, nevtralnost in sposobnost samodejnega analiziranja in vrednotenja.Analiza polimorfizma mikrosatelitskih ponovitev se izvaja s PCR ojačanjem z uporabo primerjev, ki dopolnjujejo edinstvena zaporedja ob bok mikrosatelitskim lokusom. Na začetku je bila analiza opravljena z ločevanjem reakcijskih produktov na poliakrilamidnem gelu. Kasneje so zaposleni v Applied Biosystems predlagali uporabo fluorescentno označenih primerjev z zaznavanjem reakcijskih produktov z uporabo avtomatskega laserskega detektorja (Diehl et al., 1990) in nato standardnih avtomatskih zaporednikov DNA (Ziegle et al., 1992). Označevanje temeljnih premazov z različnimi fluorescentnimi barvili omogoča analizo več markerjev hkrati na enem pasu in v skladu s tem znatno poveča produktivnost metode in poveča natančnost analize.
Prve publikacije, namenjene uporabi analize SSR za preučevanje P. infestans, so se pojavile v začetku 2000-ih. (Knapova, Gisi, 2002). Niso vsi označevalci, ki so jih predlagali avtorji, pokazali zadostne stopnje polimorfizma, vendar sta bila dva (4B in G11) vključena v nabor 12 SSR markerjev, ki so jih predlagali Lees in drugi (2006) in jih je kasneje sprejela raziskovalna mreža Eucablight (www.eucablight .org) kot standard za P. infestans. Nekaj let kasneje je bila objavljena študija o ustvarjanju sistema za multipleksno analizo DNA P. infestans na osnovi osmih SSR markerjev (Li et al., 2010). Nazadnje je ista skupina avtorjev po oceni vseh predhodno predlaganih markerjev in izbiri najbolj informativnega med njimi ter optimizaciji temeljnih premazov, fluorescentnih nalepk in pogojev ojačanja predstavila sistem enostopenjske multipleksne analize, vključno z 12 markerji (tabela 4; Li et al. , 2013a). Primerji, uporabljeni v tem sistemu, so bili izbrani in označeni z enim od štirih fluorescentnih markerjev (FAM, VIC, NED, PET), tako da se območja velikosti alelov primerkov z enakimi oznakami niso prekrivala.
Avtorji so analizo opravili na ojačevalniku PTC200 (MJ Research, ZDA) z uporabo QIAGEN multiplex PCR kompletov ali QIAGEN Typeit Microsatellite PCR kompletov. Prostornina reakcijske zmesi je bila 12.5 μL. Pogoji ojačanja so bili naslednji: za QIAGEN multiplex PCR: 95 ° C (15 min), 30x (95 ° C (20 sek), 58 ° C (90 sek), 72 ° C (60 sek), 72 ° C (20 min); za QIAGEN Type-it Microsatellite PCR: 95 ° C (5 min), 28x (95 ° C (30 sek), 58 ° C (90 sek), 72 ° C (20 sek), 60 ° C (30 minut).
Ločevanje in vizualizacija izdelkov PCR smo izvedli z uporabo avtomatskega kapilarnega analizatorja DNA ABI3730 (Applied Biosystems).
Tabela 4. Značilnosti 12 standardnih označevalcev SSR, uporabljenih za genotipizacijo P. Infestans (Li et al., 2013a)
Ime | Število alelov | Razpon velikosti aleli (bp) | Primerji |
PiG11 | 13 | 130-180 | F: NED-TGCTATTTATCAAGCGTGGG R: GTTTTCAATCTGCAGCCGTAAGA |
Pi02 | 4 | 255-275 | F: NED-ACTTGCAGAACTACCGCCC R: GTTTGACCACTTTCCTCGGTTC |
PinfSSR11 | 4 | 325-360 | F: NED-TTAAGCCACGACATGAGCTG R: GTTTAGACAATTGTTTTGTGGTCGC |
D13 | 16 | 100-185 | FAM-TGCCCCCTGCTCACTC R: GCTCGAATTCATTTTCAGACTTG |
PinfSSR8 | 4 | 250-275 | FAM-AATCTGATCGCAACTGAGGG R: GTTTACAAGATACACACGTCGCTCC |
PinfSSR4 | 7 | 280-305 | FAM-TCTTGTTCGAGTATGGCGACG R: GTTTCACTTCGGGAGAAAGGCTTC |
Pi04 | 4 | 160-175 | F: VIC-AGCGGCTTTACCGATGG R: GTTTCAGCGGCTGTTTCGAC |
Pi70 | 3 | 185-205 | F: VIC-ATGAAAATACGTCAATGCTCG R: CGTTGGATATTTCTATTTCTTCG |
PinfSSR6 | 3 | 230-250 | F: GTTTTGGTGGGGCTGAAGTTTT R: VIC-TCGCCACAAGATTTATTCCG |
Pi63 | 3 | 265-280 | F: VIC-ATGACGAAGATGAAAGTGAGG R: CGTATTTCCTGTTTATCTAACACC |
PinfSSR2 | 3 | 165-180 | F: PET-CGACTTCTACATCAACCGGC R: GTTGCTTGGACTGCGTCTTTAGC |
Pi4B | 5 | 200-295 | F: PET-AAAATAAAGCCTTTGGTTCA R: GCAAGCGAGGTTTGTAGATT |
Primer vizualizacije rezultatov analize je prikazan na sl. 6. Rezultati so bili analizirani z uporabo programske opreme GeneMapper 3.7 s primerjavo dobljenih podatkov s podatki znanih izolatov. Za lažjo razlago rezultatov analize je treba v vsako študijo vključiti 1-2 referenčna izolata z znanim genotipom.
Predlagana raziskovalna metoda je bila preizkušena na velikem številu terenskih vzorcev, nato pa so avtorji izvedli standardizacijo protokolov med laboratoriji dveh organizacij, The James Hutton Institute (Velika Britanija) in Wageningen University & Research (Nizozemska), ki je skupaj z možnostjo uporabe standardnih kart FTA za poenostavljene zbiranje in pošiljanje vzorcev DNK P. infestans, je omogočilo govoriti o možnosti komercialne uporabe tega razvoja. Poleg tega je hitra in natančna metoda genotipiziranja izolatov P. infestans z uporabo multiplex SSR analize omogočila izvedbo standardiziranih študij populacij tega patogena v svetovnem merilu in oblikovanje svetovne baze podatkov o poznem pljuču v okviru projekta Eucablight (www.eucablight.org), vključno z , vključno z rezultati mikrosatelitske analize, je omogočil sledenje nastanku in širjenju novih genotipov po vsem svetu.
Ojačan polimorfizem dolžine restrikcijskega fragmenta (AFLP). AFLP (ojačani polimorfizem dolžine fragmentov) je tehnologija za generiranje naključnih molekularnih markerjev z uporabo posebnih primerjev. Pri AFLP se DNA zdravi s kombinacijo dveh restrikcijskih encimov. Posebni adapterji se povežejo z lepljivimi konci omejevalnih fragmentov.
Te fragmente nato ojačimo z uporabo primerjev, ki dopolnjujejo sekvenco adapterja in restrikcijsko mesto in dodatno nosijo eno ali več naključnih baz na svojih 3 'koncih. Nabor dobljenih fragmentov je odvisen od restrikcijskih encimov in naključno izbranih nukleotidov na 3'-koncih začetnic (Vos in sod., 1995). AFLP - genotipizacija se uporablja za hitro preučevanje genskih sprememb različnih organizmov.
Podroben opis metode je podan v delih Muellerja, Wolfenbargerja, 1999, Savelkoul in sod., 1999. Veliko dela, ki je primerjalo ločljivost metod AFLP in SSR, so opravili kitajski raziskovalci. Proučevali so fenotipske in genotipske značilnosti 48 izolatov P. infestans, zbranih v petih regijah severne Kitajske. Spektri AFLP so razkrili osem različnih genotipov DNA, v nasprotju z genotipi SSR, pri katerih raznolikost ni bila razkrita (Guo et al., 2008).
Ojačitev s primerji, homolognimi zaporedjem mobilnih elementov
Označevalci, pridobljeni iz zaporedij retrotranspozonov, so zelo primerni za genetsko kartiranje, preučevanje genske raznolikosti in evolucijske procese (Schulman, 2006). Če so primerji izdelani tako, da dopolnjujejo stabilna zaporedja nekaterih mobilnih elementov, je mogoče ojačati genomske regije, ki se nahajajo med njimi. V študijah povzročitelja poznega plina je bila uspešno uporabljena metoda ojačevanja genomskih regij s primerjem, ki je komplementaren jedrnemu zaporedju retroazona SINE (kratki poseženi jedrski elementi) (Lavrova in Elansky, 2003). Z uporabo te metode so se pokazale razlike tudi pri nespolnih potomcih enega izolata. V zvezi s tem je bilo ugotovljeno, da je metoda med SINE - PCR zelo specifična in da je hitrost gibanja elementov SINE v genomu Phytophthora visoka.
V genomu P. infestans je bilo ugotovljenih 12 družin kratkih retrotranspozonov (SINE); raziskana je bila razširjenost vrst kratkih retrotranspozonov; razkriti so bili elementi (SINE), ki jih najdemo v genomu samo P. infestans (Lavrova, 2004).
Značilnosti uporabe metod primerjalnega preučevanja sevov v populacijskih študijah
Ko načrtujemo študijo, moramo jasno razumeti cilje, ki jih zasleduje, in uporabiti ustrezne metode. Tako nekatere metode omogočajo ustvarjanje velikega števila neodvisnih označevalnih znakov, hkrati pa imajo nizko obnovljivost in so močno odvisne od uporabljenih reagentov, reakcijskih pogojev in kontaminacije preskusnega materiala. Zato je v vsaki študiji skupine sevov treba uporabiti več standardnih (referenčnih) izolatov, vendar je tudi v tem primeru rezultate več poskusov zelo težko kombinirati.
Ta skupina metod vključuje RAPD, AFLP, InterSSR, InterSINE PCR. Po amplifikaciji dobimo veliko število fragmentov DNA različnih velikosti. Takšne tehnike je priporočljivo uporabiti, če je treba ugotoviti razlike med sorodnimi sevi (starši-potomci, divji mutanti itd.) Ali v primerih, ko je potrebna podrobna analiza majhnega vzorca. Tako se metoda AFLP pogosto uporablja pri genetskem kartiranju P. infestans (van der Lee et al., 1997) in v intrapopulacijskih študijah (Knapova, Gisi, 2002, Cooke et al, 2003, Flier et al, 2003). Takšne metode je nepraktično uporabljati pri ustvarjanju baz podatkov o sevih, saj praktično nemogoče je poenotiti računovodstvo rezultatov pri izvajanju analiz v različnih laboratorijih.
Kljub navidezni preprostosti in hitrosti izvedbe (izolacija DNK brez dobrega čiščenja, ojačanja, vizualizacije rezultatov) ta skupina metod zahteva uporabo posebne metode za dokumentiranje rezultatov: destilacija v poliakrilamidnem gelu z označenimi (radioaktivnimi ali luminiscenčnimi) primerji in naknadna izpostavljenost svetlobi ali radioaktivnemu materialu. Običajno slikanje etidij-bromid-agaroznega gela na splošno ni primerno za te metode, ker lahko se spoji veliko število fragmentov DNA različnih velikosti.
Druge metode, nasprotno, omogočajo ustvarjanje majhnega števila lastnosti z njihovo zelo visoko obnovljivostjo. V to skupino spadajo študije haplotipov mitohondrijske DNA (v Rusiji so zabeleženi le dva haplotipa Ia in IIa), vrste parjenja (večina izolatov je razdeljena na 2 vrsti: A1 in A2, samoplodni SF se redko najde) in izoptimski spektri peptidaze (dva lokusa Pep1 in Pep2 , sestavljena iz dveh izocimov) in glukoza-6-fosfat izomeraze (v Rusiji ta lastnost ni spremenljiva, čeprav je v drugih državah sveta opazen pomemben polimorfizem). Te funkcije je priporočljivo uporabljati pri analizi zbirk, sestavljanju regionalnih in globalnih baz podatkov. V primeru analize izocimov in haplotipov mitohondrijske DNA je mogoče sploh brez standardnih sevov, medtem ko sta pri analizi tipov parjenja potrebna dva testna izolata z znanimi tipi parjenja.
Reakcijski pogoji in reagenti lahko vplivajo samo na kontrast izdelka na elektroforetogramu; pojav artefaktov v tovrstnih študijah je malo verjeten.
Trenutno večino populacij v evropskem delu Rusije predstavljajo sevi obeh vrst parjenja (tabela 6), med njimi so izolati z vrstami Ia in IIa mitohondrijske DNA (drugih vrst mtDNA, ki jih v svetu po letu 1993 niso našli). Spektre izoencimov peptidaze predstavljata dva genotipa v lokusu Pep1 (100/100, 92/92 in heterozigot 92/100, genotip 92/92 pa je izredno redek (<0,3%)) in dva genotipa v lokusu Pep 2 (100/100 , 112/112 in heterozigota 100/112, pri čemer se genotip 112/112 pojavlja manj pogosto kot 100/100, vendar tudi precej pogosto).
Po letu 6 (izginotje klonske linije US-1993) ni bilo variabilnosti spektra izocimov glukoza-1-fosfat-izomeraze; vsi preučevani izolati so imeli genotip 100/100 (Elansky in Smirnov, 2002).
Tretja skupina metod omogoča pridobitev zadostne skupine neodvisnih značilnosti označevalcev z visoko obnovljivostjo. Danes v to skupino spada sonda RFLP-RG57, ki proizvaja 25-29 fragmentov DNA različnih velikosti. RFLP-RG57 se lahko uporablja tako pri analizi vzorcev kot pri sestavljanju baz podatkov. Vendar je ta metoda veliko dražja od prejšnjih, je zamudna in zahteva dovolj veliko količino visoko prečiščene DNA. Zato je raziskovalec prisiljen omejiti količino preskusnega materiala.
Razvoj RFLP-RG57 v zgodnjih 90-ih letih prejšnjega stoletja je znatno okrepil populacijske študije povzročitelja poznega plina. Postala je osnova metode, ki temelji na izbiri in analizi "klonskih črt" (glej spodaj). Skupaj z RFLP-RG57 se za identifikacijo klonskih linij uporabljajo tip parjenja, odvzem DNK (metoda RFLP-RG57), spektri izoencimov peptidaze in glukoza-6-fosfat-izomeraze ter mitohondrijski DNK. Zahvaljujoč njemu je bilo prikazano al., 1994), nadomeščanje starih populacij z novimi (Drenth et al, 1993, Sujkowski et al, 1994, Goodwin et al, 1995a), je razkrilo klonske linije, ki prevladujejo v številnih državah sveta. Študije ruskih sevov s to metodo so pokazale visok genotipski polimorfizem sevov evropskega dela in monomorfizem populacij azijskega in daljnovzhodnega dela Rusije (Elansky et al, 2001). In zdaj ta metoda ostaja glavna v populacijskih študijah P. infestans. Vendar njegovo široko distribucijo ovirajo precej visoki stroški in delovna intenzivnost pri izvedbi.
Druga obetavna tehnika, ki se redko uporablja v študijah P. infestans, je analiza mikrosatelitskih ponovitev (SSR). Trenutno se ta metoda pogosto uporablja za izolacijo klonskih linij. Za analizo sevov so bile široko uporabljene (in se še vedno uporabljajo) takšne fenotipske markerske lastnosti, kot je prisotnost genov virulenc za sorte krompirja (Avdey, 1995, Ivanyuk in sod., 2002, Ulanova in sod., 2003) in paradižnik. Do sedaj so geni za virulenco do sort krompirja izgubili svojo vrednost kot markerske lastnosti za populacijske študije zaradi pojava največjega (ali blizu njega) števila genov za virulenco v veliki večini izolatov. Hkrati se gen virulence T1 za sorte paradižnika, ki nosijo ustrezen gen Ph1, še vedno uspešno uporablja kot označevalna lastnost (Lavrova in sod., 2003; Ulanova in sod., 2003).
V mnogih delih se odpornost proti fungicidom uporablja kot označevalna lastnost. Ta lastnost je nezaželena za uporabo v populacijskih študijah zaradi precej enostavnega pojava odpornih mutacij v klonskih linijah po nanosu fungicidov, ki vsebujejo metalaksil- (ali mefenoksam-), na terenu. Na primer, pomembne razlike v stopnji odpornosti so bile prikazane znotraj klonske linije Sib1 (Elansky et al., 2001).
Tako so parjenje, izoptimski spekter peptidaze, tip mitohondrijske DNA, RFLP-RG57, SSR prednostni označevalci za ustvarjanje bank podatkov in označevanje sevov v zbirkah. Če želite primerjati omejene vzorce, če je treba uporabiti največje število značilnosti označevalnika, lahko uporabite AFLP, RAPD, InterSSR, Inter-SINE PCR (tabela 5). Vendar je treba zapomniti, da so te metode slabo ponovljive, zato je treba v vsakem posameznem poskusu (cikel ojačevalne elektroforeze) uporabiti več referenčnih izolatov.
Tabela 5. Primerjava različnih metod raziskovanja sevov P. infestans
merilo | TC | Policisti Isofer | MtDNA | RFLP-RG57 | RAPD | ISSR | SSR | AFLP | Rev. |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Količina informacij | Н | Н | Н | С | В | В | С | В | В |
Obnovljivost | В | В | В | В | Н | Н | С | С | С |
Možnost artefaktov | Н | Н | Н | Н | В | С | Н | С | В |
Stroški | Н | С | Н | В | Н | Н | Н | С | Н |
Intenzivnost dela | Н | Н | Н | В | NS * | NS * | Н | С | NS * |
Hitrost analize ** | В | Н | Н | С | Н | Н | Н | Н | Н |
Opomba: H - nizka, C - srednja, B - visoka; НС * - intenzivnost dela je nizka pri uporabi agaroznega gela ali avtomatsko
genotiper, medij - z destilacijo v poliakrilamidnem gelu z označenimi temeljnimi premazi,
** - brez števila časa, porabljenega za gojenje micelija za izolacijo DNA.
Struktura prebivalstva
Klonske črte
V odsotnosti rekombinacije ali njenega nepomembnega prispevka k strukturi populacije je populacija sestavljena iz določenega števila klonov, katerih genetska izmenjava je izjemno redka.
V takih populacijah je bolj informativno preučevati ne frekvence posameznih genov, temveč frekvence genotipov, ki imajo skupen izvor (klonske ali klonske linije) in se razlikujejo le po točkovnih mutacijah. Populacijske študije patogena poznega plina in analiza klonskih linij so se znatno pospešile od pojava metode RFLP-RG57 v zgodnjih devetdesetih letih prejšnjega stoletja. Skupaj z RFLP-RG90 se za identifikacijo klonskih linij uporabljajo vrsta parjenja, spektri izoencimov peptidaze in glukoza-57-fosfat-izomeraze ter vrsta mitohondrijske DNA. Značilnosti najpogostejših klonskih linij so prikazane v tabeli 6.
Klonirali so populacije ZDA-1 povsod do konca osemdesetih let, nato pa so ga začeli nadomeščati drugi kloni in izginjati iz Evrope in Severne Amerike. Zdaj ga najdemo na Daljnem vzhodu (Filipini, Tajvan, Kitajska, Japonska, Koreja, Koh idr., 80, Mosa idr., 1994), v Afriki (Uganda, Kenija, Ruanda, Goodwin in drugi, 1993, Vega-Sanchez et al., 1994; Ochwo et al., 2000) in v Južni Ameriki (Ekvador, Brazilija, Peru, Forbes in sod., 2002, Goodwin in sod., 1997). Samo v Avstraliji niso odkrili nobenega seva linije US-1994. Očitno so izolati P. infestans prišli v Avstralijo z novim valom selitve (Goodwin, 1).
Klon US-6 se je konec sedemdesetih migriral iz severne Mehike v Kalifornijo in tam po 70 letih brez bolezni povzročil epidemijo krompirja in paradižnika. Zaradi visoke agresivnosti je zamenjal klon US-32 in začel prevladovati na zahodni obali ZDA (Goodwin in sod., 1a).
Genotipa US-7 in US-8 so v ZDA odkrili leta 1992, že leta 1994 pa so bili široko razširjeni v ZDA in Kanadi. V eni poljski sezoni lahko klon US-8 skoraj v celoti izpodrine klon US-1 na krompirjevih ploskvah, ki so bile prvotno okužene z obema klonoma v enaki koncentraciji (Miller in Johnson, 2000).
Kloni BC-1 do BC-4 so bili ugotovljeni v Britanski Kolumbiji v majhnem številu izolatov iz Goodwin in sod., 1995b). Klon US-11 se je zelo razširil v ZDA in izpodrinil US-1 na Tajvanu. Kloni JP-1 in EC-1 so skupaj s klonoma US-1 pogosti na Japonskem oziroma v Ekvadorju (Koh in sod., 1994; Forbes in sod., 1997).
SIB-1 je klon, ki je v Rusiji prevladoval na velikem ozemlju od Moskovske regije do Sahalina. V moskovski regiji so ga odkrili leta 1993, nekatere populacije na terenu pa so sestavljali predvsem sevi te klonske linije, zelo odporni na metalaksil. Po letu 1993 se je razširjenost tega klona znatno zmanjšala. Zunaj Urala v letih 1997-1998 so SIB-1 našli povsod, z izjemo Habarovskega ozemlja (klon SIB-2 je tam razširjen). Prostorska ločitev klonov z različnimi vrstami parjenja izključuje spolni proces v Sibiriji in na Daljnem vzhodu. V Moskovski regiji prebivalstvo v nasprotju s Sibirijo predstavlja veliko klonov; skoraj vsak izolat ima edinstven multilokusni genotip (Elansky in sod., 2001, 2015). Te raznolikosti ni mogoče razložiti zgolj z uvozom sevov glive iz različnih delov sveta z uvoženim semenskim materialom. Ker se obe vrsti parjenja pojavljata v populaciji, je možno, da je njena raznolikost tudi posledica rekombinacije. Tako se v Britanski Kolumbiji domneva pojav genotipov BC-2, BC-3 in BC-4 zaradi hibridizacije klonov BC-1 in US-6 (Goodwin in sod., 1995b). Možno je, da v populaciji Moskve najdemo hibridne seve. Na primer, sevi MO-4, MO-8 in MO-11 heterozigotni za PEP lokus so lahko hibridi med sevi MO-12, MO-21, MO-22, ki imajo vrsto parjenja A2, in homozigotni za en alel lokusa PEP in seva MO-8, ki ima vrsto parjenja A1 in homozigoten za drugi alel lokusa. In če je temu tako in v sodobnih populacijah P. infestans obstaja težnja po povečanju vloge spolnega procesa, se bo informacijska vrednost analize multilokusnih klonov zmanjšala (Elansky in sod., 2001, 2015).
Razlike v klonskih linijah
Do 90. let 20. stoletja je bila klonska linija US-1 razširjena po vsem svetu. Večino terenskih in regionalnih populacij so sestavljali izključno sevi z genotipom US-1. Opazili pa so tudi razlike med izolati, ki jih je najverjetneje povzročil mutacijski postopek. Mutacije so se pojavile tako v jedrski kot v mitohondrijski DNK in so med drugim vplivale na raven odpornosti na zdravila s fenilamidom in število genov virulence. Vrstice, ki se od izvornih genotipov razlikujejo po mutacijah, so označene z dodatnimi številkami za piko, ki sledi imenu prvotnega genotipa (na primer mutantna linija US-1.1 klonske linije US-1). Linije DNK za prstne odtise US-1.5 in US-1.6 vsebujejo različne velikosti pomožnih linij (Goodwin in sod., 1995a, 1995b); klonska linija US-6.3 se od US-6 razlikuje tudi po eni pomožni liniji (Goodwin, 1997, tabela 7).
V študiji mitohondrijske DNA je bilo ugotovljeno, da v klonski liniji US-1 najdemo le mitohondrijsko DNA tipa 1b (Carter in sod., 1990). Vendar pa so pri preučevanju sevov te klonske linije iz Perua in Filipinov našli izolate, katerih mitohondrijski tipi DNK so se od prisotnosti insercij in delecij razlikovali od 1b (Goodwin, 1991, Koh et al., 1994).
Tabela 6. Multilokusni genotipi nekaterih klonskih linij P. infestans
Ime | Vrsta parjenja | Izocimi | DNA prstni odtisi | Tip MtDNA | |
GPI | PEP | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010110011 + 24 | Ib |
US-2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111010010011 + 24 | - |
US-3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1.0111000000011 + 24 | - |
US-4 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0111010010011 + 24 | - |
US-5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111010010011 + 24 | - |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0111110010011 + 24 | IIb |
US-7 | A2 | 100/111 | 100/100 | 1.0011000010011 + 24 | Ia |
US-8 | A2 | 100/111/122 | 100/100 | 1.0011000010011 + 24 | Ia |
US-9 | A1 | 100/100 | 83/100 | * | - |
US-10 | A2 | 111/122 | 100/100 | - | - |
US-11 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0101110010011 + 24 | IIb |
US-12 | A1 | 100/111 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | - |
US-14 | A2 | 100/122 | 100/100 | 1.0000000000011 + 24 | - |
US-15 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | Ia |
US-16 | A1 | 100/111 | 100/100 | 1.0001100010011 + 24 | - |
US-17 | A1 | 100/122 | 100/100 | 1.0100010000011 + 24 | - |
US-18 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | Ia |
US-19 | A2 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010000011 + 24 | Ia |
ES-1 | A1 | 90/100 | 96/100 | 1.1111010010011 + 24 | IIa |
SIB-1 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011 + 24 | IIa |
SIB-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011 + 24 | IIa |
SIB-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.1001010100011 + 24 | IIa |
MO-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000110011 + 24 | IIa |
MO-2 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000010011 + 24 | Ia |
MO-3 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101000010011 + 24 | IIa |
MO-4 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101110110011 + 24 | IIa |
MO-5 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001010010011 + 24 | IIa |
MO-6 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011 + 24 | Ia |
MO-7 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000110011 + 24 | IIa |
MO-8 | A1 | 100/100 | 92/92 | 1.0101100010011 + 24 | IIa |
MO-9 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0001000010011 + 24 | IIa |
MO-10 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101100000011 + 24 | Ia |
MO-11 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1.0101010010011 + 24 | Ia |
MO-12 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010010011 + 24 | Ia |
MO-13 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | Ia |
MO-14 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.01010010011 + 22 | Ia |
MO-15 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.101110010011 + 23 | Ia |
MO-16 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0001000000011 + 24 | IIa |
MO-17 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1.0101010110011 + 24 | Ib |
MO-18 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101110010011 + 24 | IIa |
MO-19 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | IIa |
MO-20 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | IIa |
MO-21 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1.0101010000011 + 24 | IIa |
Opomba: * - ni podatkov.
Tabela 7. Multilokusni genotipi in njihove mutirane linije
Ime | Vrsta parjenja | | DNA prstni odtisi (RG57) | Opombe | |
GPI | PEP-1 | ||||
US-1 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101000110011 | Prvotni genotip 1 |
US-1.1 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101011001101000110011 | Mutacija v PEP |
US-1.2 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101010001101000110011 | Mutacija v RG57 |
US-1.3 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101001001101000110011 | Mutacija v RG57 |
US-1.4 | A1 | 86/100 | 100/100 | 1011101010001101000110011 | Mutacija v RG57 in PEP |
US-1.5 | A1 | 86/100 | 92/100 | 1011101011001101010110011 | Mutacija v RG57 |
US-6 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010110011 | Prvotni genotip 2 |
US-6.1 | A1 | 100/100 | 92 /92 | 1011111001001100010110011 | Mutacija v PEP |
US-6.2 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011101001001100010110011 | Mutacija v RG57 |
US-6.3 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001011100010110011 | Mutacija v RG57 |
US-6.4 | A1 | 100/100 | 100/100 | 1011011001001100010110011 | Mutacija v RG57 in PEP |
US-6.5 | A1 | 100/100 | 92/100 | 1011111001001100010010011 | Mutacija v RG57 |
BR-1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1011101000001100001111011 | Prvotni genotip 3 |
BR-1.1 | A2 | 100/100 | 100/100 | 1010101000001100001110011 | Mutacija v RG57 |
Spremembe so tudi v spektrih izocimov. Praviloma jih povzroča razgradnja organizma, ki je bil sprva heterozigoten za ta encim v homozigotne. Leta 1993 smo na plodovih paradižnika identificirali sev z značilnostmi, značilnimi za US-1: prstni odtis RG57, mitohondrijski DNK in 86/100 genotip za glukozo-6-fosfatizomerazo, vendar je bil za prvi peptidazni lokus homozigoten (100/100) heterozigota 92/100, značilna za to klonsko linijo. Genotip tega seva smo poimenovali MO-17 (tabela 6). Mutantni liniji US-1.1 in US-1.4 se od US-1 razlikujeta tudi po mutacijah prvega lokusa peptidaze (tabela 7).
Mutacije, ki vodijo do sprememb števila genov virulence za sorte krompirja in paradižnika, so zelo pogoste. Opaženi so bili med izolati klonske linije US-1 pri populacijah na Nizozemskem (Drenth et al., 1994), Peruju (Goodwin et al., 1995a), Poljski (Sujkowski et al., 1991), severni Severni Ameriki (Goodwin et al., ., 1995b). Razlike v številu genov za virulenco krompirja so opazili tudi med izolati klonskih linij US-7 in US-8 v Kanadi in ZDA (Goodwin et al., 1995a), med izolati linije SIB-1 v azijskem delu Rusije (Elansky et al, 2001 ).
V monoklonskih populacijah polja so bili identificirani izolati z velikimi razlikami v stopnjah odpornosti na zdravila s fenilamidom, ki so vsi pripadali klonski liniji Sib-1 (Elansky et al, 2001, tabela 1). Skoraj vsi sevi klonske linije US-1 so zelo občutljivi na metalaksil, vendar so bili na Filipinih (Koh et al., 1994) in na Irskem (Goodwin et al., 1996) izolirani zelo odporni izolati te linije.
Sodobne populacije P. infestans
Srednja Amerika (Mehika)
Populacija P. infestans v Mehiki se močno razlikuje od drugih svetovnih populacij, kar je predvsem posledica njenega zgodovinskega položaja. Številne študije te populacije in sorodnih vrst P. infestans klade Phytophthora, pa tudi lokalne vrste rodu Solanum, so privedle do zaključka, da je razvoj patogena v osrednjem delu Mehike potekal skupaj z razvojem gostiteljskih rastlin in je bil povezan s spolno rekombinacijo (Grünwald, Flier , 2005). Obe vrsti parjenja sta zastopani v populaciji v enakih deležih, prisotnost oospor v tleh na rastlinah in gomoljih krompirja ter samoniklih sorodnih vrstah Solanum potrjuje prisotnost spolnega procesa v populaciji (Fernández-Pavía et al., 2002). Nedavne študije doline Toluca in okolice (domnevno središče izvora patogena) so potrdile visoko genetsko raznovrstnost lokalne populacije P. infestans (134 multilokusnih genotipov v vzorcu 176 vzorcev) in prisotnost več različnih subpopulacij v regiji (Wang et al., 2017). Dejavniki, ki prispevajo k tej diferenciaciji, so prostorska delitev subpopulacij, značilna za visokogorje osrednje Mehike, razlike v pogojih gojenja in sortah krompirja, ki se uporabljajo v dolinah in gorah, ter prisotnost divjih gomoljastih vrst Solanum, ki lahko delujejo kot nadomestni gostitelji (Fry et al. ., 2009).
Vendar je treba opozoriti, da so populacije P. infestans v severni Mehiki precej klonske in bolj podobne severnoameriškim populacijam, kar lahko kaže na to, da gre za nove genotipe (Fry in sod., 2009).
Severna Amerika
Severnoameriške populacije P. infestans so od nekdaj imele zelo preprosto strukturo, njihov klonski značaj pa je bil vzpostavljen že pred uporabo mikrosatelitske analize. Do leta 1987 je v ZDA in Kanadi prevladovala klonska linija US-1 (Goodwin in sod., 1995). Sredi sedemdesetih let, ko so se pojavili fungicidi na osnovi metalaksila, so ta klon začeli nadomeščati drugi, bolj odporni genotipi, ki so se preselili iz Mehike (Goodwin in sod., 70). Do konca 1998-ih. genotip US-90 je v ZDA popolnoma nadomestil genotip US-8 in postal prevladujoča klonska linija na krompirju (Fry in sod., 1; Fry in sod., 2009). Drugače je bilo s paradižnikom, ki je nenehno vseboval več klonskih linij, njihova sestava pa se je iz leta v leto spreminjala (Fry in sod., 2015).
Leta 2009 je v ZDA izbruhnila obsežna epidemija poznega krompirja na paradižniku. Značilnost te pandemije je bil njen skoraj sočasen začetek v mnogih krajih na severovzhodu ZDA in izkazalo se je, da je povezan z množično prodajo okuženih sadik paradižnika v velikih vrtnih centrih (Fry in sod., 2013). Izgube pridelka so bile ogromne. Mikrosatelitska analiza prizadetih vzorcev je pokazala, da je sev pandemije pripadal parjenju klonske linije US-22 A2. Leta 2009 je delež tega genotipa v ameriški populaciji P. infestans dosegel 80% (Fry in sod., 2013). V naslednjih letih se je delež agresivnih genotipov US-23 (večinoma na paradižniku) in US-24 (na krompirju) v populaciji nenehno povečeval, vendar se je po letu 2011 stopnja odkrivanja US-24 znatno zmanjšala in do danes približno 90% populacije patogenov v Združene države predstavlja genotip US-23 (Fry in sod., 2015).
V Kanadi, tako kot v ZDA, konec 90-ih. prevladujoči genotip US-1 je izpodrinil US-8, katerega prevladujoči položaji so ostali nespremenjeni do leta 2008. V Kanadi so bile resne epidemije poznega plina, povezane s prodajo okuženih sadik paradižnika, vendar so jih povzročili genotipi US-2009 in US-2010 (Kalischuk et al., 23). Jasna geografska diferenciacija teh genotipov je bila izjemna: ZDA-8 so prevladovale v zahodnih provincah Kanade (2012%), ZDA-23 pa v vzhodnih provincah (68%). V naslednjih letih se je ZDA-8 razširil na vzhodne regije, vendar se je njegov delež v populaciji na splošno nekoliko zmanjšal glede na pojav genotipov US-83 in US-23 v državi (Peters et al., 22). Do danes ZDA-24 ohranja prevladujoč položaj po vsej Kanadi; US-2014 je prisoten v Britanski Kolumbiji, ZDA-23 in US-8 pa v Ontariu (Peters, 23).
Tako so severnoameriške populacije P. infestans pretežno klonske črte. V zadnjih 40 letih je število odkritih klonskih genotipov doseglo 24. Kljub temu, da so v populaciji prisotni sevi obeh vrst parjenja, ostaja verjetnost pojava novih genotipov zaradi spolne rekombinacije precej majhna. Kljub temu je bilo v zadnjih 20 letih zabeleženih več primerov pojava kratkotrajnih rekombinantnih populacij (Gavino in sod., 2000; Danies in sod., 2014; Peters in drugi, 2014), v enem primeru pa je bil rezultat križanja genotip US-11 , ki je bila dolga leta utrjena v Severni Ameriki (Gavino et al., 2000). Do leta 2009 so bile spremembe v strukturi populacij povezane s pojavom novih, agresivnejših genotipov z njihovimi kasnejšimi migracijami in izseljevanjem predhodno prevladujočih predhodnikov. Kaj se je zgodilo v letih 2009–2010 V ZDA in Kanadi so epifitotiki prvič pokazali, da je v dobi globalizacije izbruhe bolezni mogoče povezati z aktivnim širjenjem novih genotipov pri prodaji okuženega sadilnega materiala.
Južna Amerika
Do nedavnega študije južnoameriških populacij P. infestans niso bile niti redne niti obsežne. Znano je, da je struktura teh populacij precej preprosta in vključuje 1-5 klonskih linij na državo (Forbes in sod., 1998). Tako so do leta 1998 na krompirju našli genotipe US-1 (Brazilija, Čile) BR-1 (Brazilija, Bolivija, Urugvaj, Paragvaj), EC-1 (Ekvador, Kolumbija, Peru in Venezuela), AR-1, AR -2, AR-3, AR-4 in AR-5 (Argentina), PE-3 in PE-7 (južni Peru). Parjenje tipa A2 je bilo prisotno v Braziliji, Boliviji in Argentini in ga ni bilo mogoče najti onkraj bolivijsko-perujske meje na območju jezera Titicaca, za katerim je v Andih prevladoval genotip EC-1 A1. Na paradižniku je US-1 ostal prevladujoči genotip po vsej Južni Ameriki.
Razmere so se bolj ali manj ohranile v 2000-ih. Pomembno je bilo odkritje v severnih Andih pri samoniklih krompirjevih sorodnikih (S. brevifolium in S. tetrapetalum) nove klonske linije EC-2 tipa A2 (Oliva in sod., 2010). Filogenetske študije so pokazale, da ta linija ni popolnoma enaka P. infestans, čeprav je z njo tesno povezana, v zvezi s katero je bilo predlagano, da se jo upošteva, pa tudi druga linija, EC-3, izolirana iz drevesa paradižnika S. betaceum, ki raste v Andih, nova vrsta, imenovana P. andina; vendar je status te vrste (samostojna vrsta ali hibrid P. infestans z neko še neznano črto) še vedno nejasen (Delgado et al., 2013).
Trenutno so vse južnoameriške populacije P. infestans klonske. Kljub prisotnosti obeh vrst parjenja ni bila ugotovljena nobena rekombinantna populacija. Na paradižniku je genotip US-1 povsod prisoten, očitno pa ga iz krompirja izpodrivajo lokalni sevi, katerih natančen izvor še vedno ni znan. V Braziliji, Boliviji in Urugvaju je prisoten genotip BR-1; v Peruju je skupaj z US-1 in EC-1 še nekaj drugih lokalnih genotipov. V Andih prevladujoč položaj ohranja klonska linija EC-1, katere povezava z nedavno odkrito P. andino ostaja neznana. Edino "nestabilno" mesto, kjer je za obdobje 2003-2013. prišlo je do pomembnih sprememb v populaciji, je postal Čile (Acuña et al., 2012), kjer je v letih 2004-2005. za populacijo patogenov je bila značilna odpornost na metalaksil in nov haplotip mitohondrijske DNA (Ia namesto prej prisotnega Ib). 2006 do 2011 v populaciji je prevladoval genotip 21 (po SSR), katerega delež je dosegel 90%, nato pa je dlan prešla v genotip 20, katerega pogostnost v naslednjih dveh letih je bila približno 67% (Acuña, 2015).
Europe
V zgodovini Evrope sta bila vsaj dva vala preseljevanja P. infestans iz Severne Amerike: v 1. stoletju. (ZELIŠČE-1) in začetek 70. stoletja (ZDA-1). Vsesplošna porazdelitev fungicidov, ki vsebujejo metalaksil, v XNUMX. letih. privedlo do premika prevladujočega genotipa US-XNUMX in njegove nadomestitve z novimi genotipi. Posledično je bilo v večini držav zahodne Evrope populacije patogena zastopanih predvsem z več klonskimi linijami.
Uporaba mikrosatelitske analize za analizo populacij patogenov je omogočila prepoznavanje resnih sprememb, ki so se zgodile v zahodni Evropi v obdobju 2005-2008. Leta 2005 je bila v Veliki Britaniji odkrita nova klonska linija, imenovana 13_A2 (ali "Modra 13"), za katero je značilen tip parjenja A2 , visoka agresivnost in odpornost na fenilamide (Shaw et al., 2007). Isti genotip so našli v vzorcih, zbranih leta 2004 na Nizozemskem in v severni Franciji, kar kaže na to, da je v Združeno kraljestvo migriral iz celinske Evrope, verjetno s semenskim krompirjem (Cooke et al., 2007). Študija genoma predstavnikov te klonske linije je pokazala visoko stopnjo polimorfizma njenega zaporedja (do leta 2016 je število njegovih subklonskih variacij doseglo 340) in znatno stopnjo variacije na ravni izražanja genov, vklj. efektorski geni med okužbo rastlin (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017). Te lastnosti, skupaj s podaljšanim trajanjem biotrofne faze, bi lahko povzročile povečano agresivnost 13_A2 in njegovo sposobnost, da okuži celo sorte krompirja, odporne na pozno ptico.
V naslednjih nekaj letih se je genotip hitro razširil po državah severozahodne Evrope (Velika Britanija, Irska, Francija, Belgija, Nizozemska, Nemčija) s hkratnim izpodrivanjem prej prevladujočih genotipov 1_A1, 2_A1, 8_A1 (Montarry et al., 2010; Gisi et al. , 2011; Van den Bosch in sod., 2011; Cooke, 2015; Cooke, 2017). Po podatkih spletne strani www.euroblight.net je delež 13_A2 v populacijah teh držav dosegel 60-80% in več; prisotnost tega genotipa so zabeležili tudi v nekaterih državah vzhodne in južne Evrope. Vendar v letih 2009-2012. 13_A2 je izgubil prevladujoči položaj v Veliki Britaniji in Franciji, tako da je popustil na črto 6_A1 (8_A1 na Irskem), na Nizozemskem in v Belgiji pa so ga delno nadomestili genotipi 1_A1, 6_A1 in 33_A2 (Cooke et al., 2012; Cooke, 2017; Stellingwerf, 2017).
Do danes je približno 70% zahodnoevropske populacije P. infestans monoklonsko. Glede na spletno stran www.euroblight.net prevladujejo genotipi v državah severozahodne Evrope (Združeno kraljestvo, Francija,
Nizozemska, Belgija) ostajata približno v enakih razmerjih 13_A2 in 6_A1, slednje praktično ni mogoče najti zunaj določene regije (z izjemo Irske), ima pa že vsaj 58 podklonov (Cooke, 2017). Spremembe 13_A2 so v opaznem številu prisotne v Nemčiji, občasno pa jih opažamo tudi v državah srednje in južne Evrope. Genotip 1_A1 predstavlja pomemben del populacije Belgije ter delno Nizozemske in Francije. Genotip 8_A1 se je v evropski populaciji ustalil na ravni 3-6%, z izjemo Irske, kjer ohranja vodilni položaj in je razdeljen na dva podklona (Stellingwerf, 2017). Nazadnje je bilo leta 2016 zabeleženo povečanje pogostosti pojavljanja novih genotipov 36_A2 in 37_A2, prvič zabeleženo v letih 2013–2014; do danes te genotipe najdemo na Nizozemskem in v Belgiji ter delno v Franciji in Nemčiji ter v južnem delu Velike Britanije (Cooke, 2017). Unikatni genotipi vsako leto predstavljajo približno 20–30% zahodnoevropske populacije.
V nasprotju z Zahodno Evropo do takrat, ko se je pojavil genotip 13_A2, populacije Severne Evrope (Švedska, Norveška, Danska, Finska) niso predstavljale klonske črte, temveč veliko število edinstvenih genotipov (Brurberg et al.,
2011). V obdobju aktivnega širjenja 13_A2 v zahodni Evropi je bila prisotnost tega genotipa v Skandinaviji opažena šele leta 2011, ko so ga prvič odkrili na Severnem Jutlandu (Danska), kjer gojijo predvsem industrijske sorte krompirja z aktivno uporabo metalaksila, ki vsebuje fungicidi (Nielsen et al., 2014). Po navedbah www.euroblight.net so leta 13 v več vzorcih z Norveške in Danske odkrili tudi genotip 2_A2014, leta 2016 pa tudi v več norveških vzorcih; poleg tega so leta 2013 na Finskem opazili prisotnost genotipa 6_A1 v majhni količini. Glavni razlog za neuspeh 13_A2 in drugih klonskih črt pri osvajanju Skandinavije so podnebne razlike te regije od držav zahodne Evrope.
Poleg tega, da hladna poletja in hladne zime prispevajo k preživetju oospor in ne vegetativnega micelija (Sjöholm et al., 2013), zmrzovanje tal pozimi (ki se običajno ne zgodi v toplejših državah zahodne Evrope) prispeva k sinhronizaciji kalitve in sajenja oospor. krompir, kar povečuje njihovo vlogo vira primarne okužbe (Brurberg in sod., 2011). Omeniti je treba tudi, da v severnih razmerah razvoj okužbe z oosporami presega razvoj gomoljaste okužbe, kar na koncu preprečuje prevlado še bolj agresivnih, a pozneje razvitih klonskih linij (Yuen, 2012). Struktura najbolj preučenih populacij P. infestans v vzhodni Evropi (Poljska, baltske države) je zelo podobna strukturi v Skandinaviji.
Tu sta prisotni tudi obe vrsti parjenja in velika večina genotipov, določenih z analizo SSR, je edinstvenih (Chmielarz et al., 2014; Runno-Paurson et al., 2016). Tako kot v severni Evropi tudi porazdelitev klonskih linij (predvsem genotipa 13_A2) praktično ni vplivala na lokalne populacije patogena, ki ob odsotnosti izrazitih prevladujočih linij ohranjajo visoko stopnjo raznolikosti.
Prisotnost 13_A2 občasno opazimo na poljih s komercialnimi sortami krompirja. V Rusiji se razmere razvijajo na podoben način. Mikrosatelitska analiza izolatov P. infestans, zbranih v letih 2008–2011 v 10 različnih regijah evropskega dela Rusije pokazala visoko stopnjo genotipske raznolikosti in popolno pomanjkanje sovpadanj z evropskimi klonskimi črtami (Statsyuk et al., 2014). Nekaj let kasneje je študija vzorcev P. infestans, zbranih v regiji Leningrad v letih 2013–2014, pokazala pomembne razlike med njimi in genotipi iz te regije, ugotovljene v prejšnji študiji. V obeh študijah zahodnoevropskih genotipov niso našli (Beketova et al., 2014; Kuznetsova et al., 2016).
Velika genetska raznovrstnost vzhodnoevropskih populacij P. infestans in odsotnost prevladujočih klonskih linij v njih je lahko posledica več razlogov. Prvič, tako kot v severni Evropi, podnebne razmere v obravnavanih državah prispevajo k nastanku oospor kot primarnega vira okužbe (Ulanova in sod., 2010; Chmielarz in sod., 2014). Drugič, pomemben delež krompirja, pridelanega v teh državah, gojijo na majhnih zasebnih kmetijah, pogosto obkroženi z gozdovi ali drugimi ovirami za prost pretok nalezljivega materiala (Chmielarz in sod., 2014). Praviloma krompir, gojen v takih razmerah, praktično ne obdelujemo s kemikalijami, izbira sort pa temelji na njihovi odpornosti proti pozni plesni, tj. ni selektivnega pritiska za agresivnost in odpornost na metalaksil, ki odpornim genotipom, kot je 13_A2, odvzema prednosti pred drugimi genotipi (Chmielarz et al., 2014). Nazadnje zaradi majhnosti zemljišč njihovi lastniki običajno ne izvajajo kolobarjenja, saj že leta gojijo krompir na istem mestu, kar prispeva k kopičenju gensko raznolikega inokuluma (Runno-Paurson et al., 2016; Elansky, 2015; Elansky et al. ., 2015).
Asia
Do nedavnega je bila struktura populacij P. infestans v Aziji razmeroma slabo razumljena. Vedelo se je, da ga predstavljajo predvsem klonske črte, učinek spolne rekombinacije na pojav novih genotipov pa je zelo majhen. Tako je na primer v letih 1997-1998. V azijskem delu Rusije (Sibirija in Daljni vzhod) so populacijo patogenov predstavljali le trije genotipi s prevlado genotipa SIB-1 (Elansky et al., 2001). Prisotnost linij klonskih patogenov je bila dokazana v državah, kot so Kitajska, Japonska, Koreja, Filipini in Tajvan (Koh et al., 1994; Chen et al., 2009). Klonska linija US-1 je prevladovala na velikem ozemlju Azije v poznih 90-ih - zgodnjih 2000-ih. skoraj povsod so ga začeli nadomeščati drugi genotipi, ki pa so se umaknili novim. V večini primerov so bile spremembe v strukturi in sestavi populacij v azijskih državah povezane z migracijo novih genotipov od zunaj. Tako imajo na Japonskem, razen genotipa JP-3, vsi drugi japonski genotipi, ki so se pojavili po US-1 (JP-1, JP-2, JP-3), bolj ali manj dokazano zunanje poreklo (Akino et al., 2011). ... Na Kitajskem trenutno obstajajo tri glavne populacije patogenov z jasno geografsko delitvijo; Med temi populacijami ni pretoka genov ali je zelo šibek (Guo et al., 2010; Li et al., 2013b). Genotip 13_A2 se je pojavil na ozemlju Kitajske v njenih južnih provincah (Junan in Sečuan) v letih 2005-2007 in v letih 2012-1014. je bil viden tudi na severovzhodu države (Li et al., 2013b). V Indiji se je 13_A2 verjetno pojavil istočasno kot na Kitajskem, najverjetneje z okuženim semenskim krompirjem (Chowdappa et al., 2015), in v letih 2009–2010. je na paradižniku na jugu države povzročil resno epifitozo poznega plina, nato pa se je razširil na krompir in leta 2014 povzročil izbruh poznega plina v Zahodni Bengaliji, kar je povzročilo propad in samomor številnih lokalnih kmetov (Fry, 2016).
Afrika
Do leta 2008-2010 sistematične študije P. infestans v afriških državah niso bile izvedene. Trenutno lahko afriške populacije P. infestans razdelimo v dve skupini in ta delitev je jasno povezana z uvozom semenskega krompirja iz Evrope.
V severni Afriki, ki aktivno uvaža semenski krompir iz Evrope, je vrsta parjenja A2 široko zastopana v skoraj vseh regijah, kar daje teoretično možnost pojava novih genotipov kot posledice spolne rekombinacije (Corbière et al., 2010; Rekad et al., 2017). Poleg tega v Alžiriji opazimo prisotnost genotipov 13_A2, 2_A1 in 23_A1 z izrazito prevlado prvega od njih, pa tudi postopno zmanjševanje deleža edinstvenih genotipov do popolnega izginotja (Rekad et al., 2017). V nasprotju s preostalo regijo je v Tuniziji (z izjemo severovzhodne države) populacija patogenov zastopana predvsem z vrsto parjenja A1 (Harbaoui et al., 2014).
Tu prevladuje klonska linija NA-01. Na splošno je delež klonskih linij v populaciji le 43%. V vzhodni in južni Afriki, kjer je obseg uvoza semen izginjajoče majhen (Fry et al., 2009), P. infestans predstavljata le dve klonski liniji tipa A1, US-1 in KE-1, slednja pa aktivno izpodriva krompir ( Pule et al., 2012; Njoroge et al., 2016). Do danes imata oba genotipa opazno število subklonskih variacij.
Slovenija
Prvo poročilo o nalezljivem krompirju na krompirju v Avstraliji sega v leto 1907, prva epifitotija, ki jo je verjetno povzročil obilen dež v poletnih mesecih, pa se je zgodila v letih 1909-1911. (Drenth in sod., 2002). Na splošno pa pozni ožig za državo nima pomembnega gospodarskega pomena. Občasni izbruhi poznega plina, ki jih povzročajo vremenske razmere, ki zagotavljajo visoko vlažnost zraka, se ne pojavljajo pogosteje kot enkrat na 5-7 let in so lokalizirani predvsem v severni Tasmaniji in osrednji Viktoriji. V zvezi z zgoraj navedenim praktično ni publikacij, namenjenih proučevanju strukture avstralske populacije P. infestans. Zadnje razpoložljive informacije so od leta 1998 do 2000. (Drenth in sod., 2002). Po mnenju avtorjev je bilo prebivalstvo zvezne države Victoria klonska linija US-1.3, kar je posredno potrdilo migracijo tega genotipa iz ZDA. Tasmanski osebki so bili razvrščeni kot AU-3, drugače od genotipov, ki so bili takrat prisotni v drugih delih sveta.
Značilnosti razvoja poznega plina v Rusiji
V Evropi se kot primarni inokulum na krompirju štejejo okužbe z bolnimi semenskimi gomolji, oosporami, ki so prezimile v tleh, pa tudi zoosporangije, ki jih je veter prinesel iz rastlin, zraslih iz prezimljenih gomoljev na lanskih poljih ("prostovoljne" rastline) ali na kupih izločenih. zaznamek za shranjevanje gomoljev. Od teh rastline, gojene na kupu zavrženih gomoljev, veljajo za najnevarnejši vir okužbe. tam je število vzklilih gomoljev pogosto veliko in zoosporangije je mogoče iz njih prenašati na velike razdalje. Preostali viri (oospore, prostovoljne rastline) niso tako nevarni, ker ni običajno gojiti rastlin na istih poljih pogosteje kot enkrat na 3-4 leta. Okužba z obolelimi gomolji semen je zaradi dobrega sistema za nadzor kakovosti semen tudi minimalna.
Na splošno je količina inokuluma v evropskih populacijah omejena, zato je naraščanje epidemije precej počasno in jo je mogoče uspešno nadzorovati s kemičnimi fungicidi. Glavna naloga v evropskih razmerah je boj proti okužbi v fazi, ko se začne množično razprševanje zoosporangije iz prizadetih rastlin.
V Rusiji je položaj popolnoma drugačen. Večino pridelka krompirja in paradižnika gojimo na majhnih zasebnih vrtovih; zaščitni ukrepi se na njih sploh ne izvajajo, ali pa se fungicidna obdelava izvaja v nezadostnem številu in se začne po pojavu poznega pojava na vrhovih. Posledično so zasebni zelenjavni vrtovi glavni vir okužbe, s katere veter zoosporangije prenaša na komercialne zasaditve. To potrjujejo tudi naša neposredna opazovanja v regijah v Moskvi, Brjansku, Kostromi in Rjazanu: poškodbe rastlin na zasebnih vrtovih opazimo že pred začetkom fungicidnih obdelav komercialnih zasaditev. Nato epidemijo na velikih poljih omeji uporaba fungicidnih pripravkov, medtem ko se na zasebnih vrtovih hitro razvije pozni ožig.
V primeru nepravilne ali "proračunske" obdelave komercialnih zasaditev se na poljih pojavijo žarišča poznega plina; kasneje se aktivno razvijajo in zajemajo vedno večja območja (Elansky, 2015). Okužba na zasebnih vrtovih pomembno vpliva na epidemije na komercialnih področjih. V vseh pridelovalcih krompirja v Rusiji je površina, ki jo zaseda krompir na zasebnih vrtovih, nekajkrat večja od celotne površine polj velikih proizvajalcev. V takem okolju lahko zasebne zelenjavne vrtove obravnavamo kot globalni vir inokuluma za komercialna polja. Poskusimo prepoznati tiste lastnosti, ki so značilne za genotipe sevov na zasebnih vrtovih.
Sajenje nesemenskega in karantenskega nadzora jedilnega krompirja, paradižnikovega semena, pridobljenega od dvomljivih tujih proizvajalcev, dolgotrajno gojenje krompirja in paradižnika na istih površinah, nepravilna obdelava fungicidov ali njihova popolna odsotnost vodi v hude epifitozije v zasebnem sektorju, katerih rezultat je brezplačen križanje, hibridizacija in nastanek oospor na zasebnih vrtovih. Posledično je opažena zelo velika genotipska raznolikost patogena, ko je skoraj vsak sev po svojem genotipu edinstven (Elansky in sod., 2001, 2015). Z zasaditvijo semenskega krompirja z različnim genetskim poreklom ni verjetno, da bi se pojavile klonske linije, specializirane za napad na določeno sorto. Izbrani sevi se v takem primeru odlikujejo po svoji vsestranskosti glede na prizadete sorte, večina jih ima blizu največjega števila genov za virulenco. To se zelo razlikuje od sistema "klonskih črt", značilnega za velika polja kmetijskih podjetij s pravilno nameščenim sistemom zaščite pred nalezljivimi cvetovi. "Klonske črte" (kadar so vsi sevi povzročiteljev poznega gripa na terenu predstavljeni z enim ali več genotipi) so povsod prisotne v državah, kjer pridelovanje krompirja opravljajo izključno velike kmetije: ZDA, Nizozemska, Danska itd. gojenje krompirja, večja je tudi genotipska raznolikost na zasebnih vrtovih. Konec 20. stoletja so bile v azijskem in daljnovzhodnem delu Rusije razširjene "klonske črte" (Elansky in sod., 2001), kar je očitno posledica uporabe istih sort krompirja izključno za sajenje. V zadnjem času so se tudi razmere v teh regijah začele spreminjati v smeri povečanja genotipske raznolikosti populacij.
Pomanjkanje intenzivnega zdravljenja s fungicidnimi pripravki ima še eno, neposredno posledico - na vrtovih se ne kopiči odpornih sevov. Naši rezultati dejansko kažejo, da se na odpornih na metalaksil seve najdemo bistveno redkeje na zasebnih vrtovih kot na komercialnih zasaditvah.
Neposredna bližina zasaditve krompirja in paradižnika, značilna za zasebne vrtove, olajša selitev sevov med temi pridelki, zaradi česar je v zadnjem desetletju med sevi, izoliranimi iz krompirja, delež sevov, ki nosijo gen za odpornost na sorte češnjevega paradižnika (T1), prej značilen le za " paradižnikov "sev. Sevi z genom T1 so v večini primerov zelo agresivni tako do krompirja kot paradižnika.
V zadnjih letih se je paradižnik na paradižniku začel pojavljati veliko prej kot na krompirju. Sadike paradižnika so lahko okužene z oosporami v tleh ali oosporami, ki so prisotne v paradižnikovih semenih ali se nanje držijo (Rubin in sod., 2001). V zadnjih 15 letih se je v trgovinah pojavilo veliko poceni embaliranih semen, večinoma uvoženih, večina majhnih proizvajalcev pa je prešla na njihovo uporabo. Semena lahko vsebujejo seve z genotipi, značilnimi za regije njihovega gojenja. V prihodnosti so ti genotipi vključeni v spolni proces na zasebnih vrtovih, kar vodi v nastanek popolnoma novih genotipov.
Tako lahko trdimo, da so zasebni vrtovi globalni "talilni lonec", v katerem se kot rezultat izmenjave genskega materiala predelajo obstoječi genotipi in pojavijo popolnoma novi. Poleg tega njihova izbira poteka v pogojih, ki se zelo razlikujejo od pogojev, ustvarjenih za krompir na velikih kmetijah: odsotnost fungicidne stiskalnice, sortna enakomernost zasaditev, prevladovanje rastlin, ki jih prizadenejo različne oblike virusne in bakterijske okužbe, bližina paradižnikov in divjih nočnih senčnikov, aktivno križanje in tvorba oospore, možnost za oospore, ki bodo naslednje leto vir okužbe.
Vse to vodi do zelo velike genotipske raznolikosti populacij dvorišč. V razmerah epifitotikov na zelenjavnih vrtovih se poznajo zelo hitro in sprostijo se ogromne spore, ki letijo na bližnje komercialne zasaditve. Po prihodu spora na komercialna področja s pravilnim sistemom kmetijske tehnologije in kemične zaščite pa spore praktično nimajo možnosti sprožiti epifitotike na terenu, kar je posledica odsotnosti klonskih linij, odpornih proti fungicidom in specializiranih za gojeno sorto.
Drug vir primarnega inokuluma so lahko oboleli gomolji, ujeti v komercialne sadike. Te gomolje so praviloma gojili na poljih z dobro kmetijsko tehnologijo in intenzivno kemijsko zaščito. Genotipi izolatov, ki so prizadeli gomolje, so prilagojeni razvoju lastne sorte. Ti sevi so za komercialno zasaditev bistveno bolj nevarni kot inokulumi z zasebnih vrtov. Tudi rezultati naše raziskave podpirajo to domnevo. Populacije, izolirane z velikih polj s pravilno izvedeno kemijsko zaščito in dobro kmetijsko tehnologijo, se ne razlikujejo v visoki genotipski pestrosti. Pogosto gre za več klonskih linij, ki so zelo agresivne.
Sevi komercialnega semenskega materiala lahko vstopijo v populacije na zelenjavnih vrtovih in sodelujejo v procesih, ki se v njih odvijajo. Vendar pa bo na zelenjavnem vrtu njihova konkurenčnost veliko nižja kot na komercialnem področju in kmalu bodo prenehali obstajati v obliki klonske črte, vendar se njihovi geni lahko uporabljajo v populaciji "vrtov".
Okužba, ki se med nabiranjem razvije na prostovoljnih rastlinah in na kupih izločenih gomoljev, za Rusijo ni tako pomembna, ker V glavnih regijah gojenja krompirja v Rusiji opazimo globoko zmrzovanje tal pozimi, rastline iz gomoljev, ki so prezimile v tleh, pa se redko razvijejo. Poleg tega, kot kažejo naši poskusi, povzročitelj poznega plina ne preživi pri negativnih temperaturah niti na gomoljih, ki so ohranili sposobnost preživetja. V sušnem območju, kjer izvajajo gojenje zgodnjega krompirja, je zaradi suhe in vroče rastne sezone pozni oreh precej redek.
Tako trenutno opažamo delitev populacij P. infestans na populacije „polj“ in „vrt“. Vendar pa so v zadnjih letih opazili procese, ki vodijo do konvergence in medsebojnega prodiranja genotipov iz teh populacij.
Med njimi je mogoče opaziti splošno povečanje pismenosti malih proizvajalcev, pojav dostopnih majhnih zavojčkov semenskega krompirja, širjenje fungicidnih pripravkov v majhnih pakiranjih in izgubo strahu pred "kemijo" med prebivalstvom.
Pojavijo se razmere, ko so zaradi močne dejavnosti enega dobavitelja celotne vasi zasajene s semenskimi gomolji iste sorte in opremljene z majhnimi paketi istih pesticidov. Predvidevamo lahko, da bo krompir iste sorte na komercialnih zasaditvah v bližini.
Po drugi strani pa nekatera podjetja za trgovanje s pesticidi promovirajo „proračunske“ sheme kemične obdelave. V tem primeru je število priporočenih načinov zdravljenja podcenjeno in ponujajo se najcenejši fungicidi, poudarek pa ni na preprečevanju razvoja poznega osipa do košnje vršičkov, temveč na nekaj zamude pri epifitotiji, da bi povečali donos. Takšne sheme so ekonomsko upravičene pri gojenju jedilnega krompirja iz nizko kakovostnega semenskega materiala, kadar načeloma ni govora o pridobivanju visokega donosa. Vendar v tem primeru v nasprotju z vrtnimi populacijami izravnano genetsko ozadje krompirja prispeva k izbiri določenih fizioloških ras, ki so za to sorto zelo nevarne.
Na splošno se nam zdijo težnje po konvergenci "vrtnih" in "poljskih" načinov pridelave krompirja precej nevarne. Da bi preprečili njihove negativne posledice tako v domačem kot v komercialnem sektorju, bo treba nadzorovati sortiment semenskega krompirja in paleto fungicidov, ki se zasebnikom ponujajo v majhni embalaži, ter slediti shemam zaščite krompirja in uporabi fungicidnih pripravkov v komercialnem sektorju.
Na področjih zasebnega sektorja se intenzivno razvija ne le poznak dreves, temveč tudi Alternaria. Večina lastnikov parcel za zasebno gospodinjstvo ne sprejme posebnih ukrepov za zaščito pred zdravilom Alternaria, pri čemer se zdravilo Alternaria odpravi za naravno venenje listja ali razvoj poznega plina. Z obsežnim razvojem Alternaria na dovzetnih sortah lahko gospodinjske parcele služijo kot vir inokuluma za komercialne zasaditve.
Mehanizmi variabilnosti
Proces mutacije
Ker je pojav mutacij naključen proces, ki poteka z nizko frekvenco, je pojav mutacij na katerem koli lokusu odvisen od pogostosti mutacij tega lokusa in velikosti populacije. Pri preučevanju pogostosti mutacij sevov P. infestans običajno določimo število kolonij, ki rastejo na selektivnih hranilnih gojiščih po obdelavi s kemičnimi ali fizičnimi mutageni. Kot je razvidno iz podatkov, predstavljenih v tabeli 8, se lahko pogostost mutacij istega seva na različnih lokusih razlikuje za več vrst velikosti. Velika pogostnost mutacij odpornosti na metalaksil je lahko eden od razlogov za kopičenje sevov, odpornih proti njemu, v naravi.
Pogostost spontanih ali induciranih mutacij, izračunana na podlagi laboratorijskih poskusov, ne ustreza vedno procesom, ki se pojavljajo v naravnih populacijah, in sicer iz naslednjih razlogov:
1. Pri asinhronih jedrskih cepitvah je nemogoče oceniti pogostost mutacij na jedrsko generacijo. Zato večina poskusov zagotavlja informacije samo o pogostosti mutacij, ne da bi razlikovali med dvema mutacijskima dogodkoma in enim dogodkom po mitozi.
2. Enostopenjske mutacije običajno zmanjšajo ravnovesje genoma, zato se skupaj s pridobitvijo nove lastnosti zmanjša tudi splošna pripravljenost organizma. Večina eksperimentalno pridobljenih mutacij ima zmanjšano agresivnost in v naravnih populacijah ni zabeleženih. Tako je bil korelacijski koeficient med stopnjo odpornosti mutantov P. infestans proti fungicidom s fenilamidom in stopnjo rasti v umetnem okolju v povprečju (-0,62), odpornost proti fungicidom in agresivnost na listih krompirja (-0,65) (Derevyagina in sod. , 1993), kar kaže na slabo kondicijo mutantov. Mutacije odpornosti na dimetomorf je spremljalo tudi močno zmanjšanje sposobnosti preživetja (Bagirova in sod., 2001).
3. Večina spontanih in induciranih mutacij je recesivnih in se v eksperimentih ne kažejo fenotipsko, temveč predstavljajo skrit rezervo spremenljivosti v naravnih populacijah. Mutirani sevi, izolirani v laboratorijskih poskusih, imajo dominantne ali poldominantne mutacije (Kulish in Dyakov, 1979). Očitno jedrska diploidija pojasnjuje neuspešne poskuse pridobivanja mutantov pod vplivom UV obsevanja, ki so virulentni na prej odporne sorte (McKee, 1969). Po avtorjevih izračunih se takšne mutacije lahko pojavijo s frekvenco manj kot 1: 500000. Zaradi spolne ali nespolne rekombinacije lahko pride do prehoda recesivnih mutacij v homozigotno, fenotipsko izraženo stanje (glej spodaj). Toda tudi v tem primeru lahko mutacijo prikrijejo dominantni aleli jeder divjega tipa v cenotičnem (večjedrnem) miceliju in fenotipsko fiksirajo le med tvorbo enojedrnih zoospor.
Tabela 8. Pogostost mutacij P. infestans na snovi, ki zavirajo rast, pod delovanjem nitrosometilurea (Dolgova, Djakov, 1986; Bagirova in sod., 2001)
Povezava | Frekvenca mutacije |
Oksitetraciklin | 6,9 10 x-8 |
Blasticidin S | X 7,2 10-8 |
Streptomicin | 8,3 x10-8 |
Trihotecin | 1,8 10 x-8 |
Cikloheksimid | 2,1 10 x-8 |
Daaconil | <4 x 10-8 |
Dimetomorf | 6,3 10 x-7 |
Metalaxil | 6,9 10 x-6 |
Velikost populacije igra tudi odločilno vlogo pri nastanku spontanih mutacij. V zelo velikih populacijah, pri katerih je število celic N> 1 / a, kjer je a stopnja mutacije, mutacija preneha biti naključen pojav (Kvitko, 1974).
Izračuni kažejo, da s povprečno okuženostjo krompirjevega polja (35 pik na rastlino) na enem hektarju dnevno nastane 8x1012 spor (Dyakov in Suprun, 1984). Očitno takšne populacije vsebujejo vse mutacije, ki jih dopušča vrsta izmenjave v posameznem lokusu. Celo redko mutacijo, ki se pojavlja s frekvenco 10–9, bo doseglo tisoč posameznikov od milijonov, ki živijo na enem hektarju krompirjevega polja. Pri mutacijah, ki se pojavljajo z večjo pogostnostjo (na primer 10-6), se v takšni populaciji lahko dnevno pojavijo različne parne mutacije (hkrati na dveh lokusih), tj. mutacijski postopek bo nadomestil rekombinacijo.
Migracije
Za P. infestans sta znani dve glavni vrsti selitve: na bližnjo razdaljo (znotraj krompirjevega polja ali sosednjih polj) s širjenjem zoosporangije z zračnimi tokovi ali deževno pršico in na velike razdalje - s sajenjem gomoljev ali prepeljanih plodov paradižnika. Prva metoda predvideva širitev žarišča bolezni, druga - ustvarjanje novih žarišč na krajih, oddaljenih od primarnega.
Širjenje okužbe z gomolji in sadjem paradižnika ne prispeva le k nastanku bolezni na novih krajih, temveč je tudi glavni vir genske raznolikosti v populacijah. V Moskovski regiji gojijo krompir, ki ga prinašajo iz različnih regij Rusije in Zahodne Evrope. Plodove paradižnika prinašajo iz južnih predelov Rusije (Astrahanska regija, Krasnodarsko ozemlje, Severni Kavkaz). Paradižnikova semena, ki so lahko tudi vir okužbe (Rubin in sod., 2001), uvažajo tudi iz južnih regij Rusije, Kitajske, evropskih držav in drugih držav.
Po izračunih E. Mayr (1974) genetske spremembe v lokalni populaciji, ki jih povzročajo mutacije, redko presežejo 10-5 na lokus, medtem ko je v odprtih populacijah izmenjava zaradi nasprotnega pretoka genov vsaj 10-3 - 10-4.
Migracija okuženih gomoljev je odgovorna za vstop P. infestans v Evropo, ki se širi po vseh regijah sveta, kjer gojijo krompir; povzročili so najresnejše spremembe prebivalstva. Pozni krompir se je na ozemlju Ruskega imperija pojavil skoraj sočasno z njegovim pojavljanjem v Zahodni Evropi.
Ker je bila bolezen prvič opažena v 1846-1847 v baltskih državah in se je šele v naslednjih letih razširila v Belorusiji in severozahodnih regijah Rusije, je njen zahodnoevropski izvor očiten. Prvi vir poznega plina v starem svetu ni tako očiten. Hipoteza, ki so jo razvili Fry in sod. (Fry in sod., 1992; Fry, Goodwin, 1995, Goodwin in sod., 1994), nakazuje, da je parazit najprej prišel iz Mehike v Severno Ameriko, kjer se je razširil skozi pridelke, nato pa je bil prepeljan v zahodno Evropo. (slika 7).
Zaradi večkratnega odnašanja (dvojni učinek "ozkega grla") so v Evropo prišli posamezni kloni, katerih potomci so povzročili pandemijo na celotnem ozemlju starega sveta, kjer gojijo krompir. Kot dokaz te hipoteze avtorji najprej navajajo vseprisotno pojavljanje samo ene vrste parjenja (A1) in drugič homogenost genotipov preučevanih sevov iz različnih regij (vsi temeljijo na molekularnih markerjih, vključno z dvema izocimskima lokusoma, vzorci prstnih odtisov DNA in struktura mitohondrijske DNA je enaka in ustreza klonu US-2, opisanemu v ZDA). Nekateri podatki pa vzbujajo dvome o vsaj nekaterih določbah navedene hipoteze. Analiza mitohondrijske DNA P. infestans, izolirane iz herbarijskih vzorcev krompirja, okuženih v prvem epifitoznem obdobju v 1-ih letih, je pokazala, da se v strukturi mitohondrijske DNA razlikujejo od klona US-40, ki je bil torej vsaj ni edini vir okužbe v Evropi (Ristaino et al, 1).
Položaj poznega plina se je v 80. letih XNUMX. stoletja spet poslabšal. Pojavile so se naslednje spremembe:
1) Povprečna agresivnost populacije se je povečala, kar je privedlo zlasti do širokega širjenja najbolj škodljive oblike poznega plina - poškodbe pecljev in stebel.
2) V času poznega krompirja na krompirju je prišlo do premika - od konca julija do začetka julija in celo do konca junija.
3) Tip parjenja A2, ki ga prej ni bilo v starem svetu, je postalo vseprisotno.
Pred spremembami sta bila dva dogodka: množična uporaba novega fungicida metalaksila (Schwinn in Staub, 1980) in pojav Mehike kot svetovnega izvoznika krompirja (Niederhauser, 1993). V skladu s tem sta bila navedena dva razloga za spremembe populacije - pretvorba tipa parjenja pod vplivom metalaksila (Ko, 1994) in množično vnašanje novih sevov z okuženimi gomolji iz Mehike (Fry in Goodwin, 1995). Čeprav je medsebojne pretvorbe vrst parjenja pod vplivom metalaksila dosegel ne le Ko, ampak tudi pri delih, opravljenih v laboratoriju Moskovske državne univerze (Savenkova, Chherepennicova-Anikina, 2002), je druga hipoteza zaželena. Skupaj s pojavom druge vrste parjenja so se zgodile resne spremembe v genotipih ruskih sevov P. infestans, vključno z nevtralnimi geni (izocim in lokusi RFLP), pa tudi v strukturi mitohondrijske DNA. Kompleksa teh sprememb ni mogoče razložiti z delovanjem metalaksila; namesto tega je prišlo do množičnega uvoza novih sevov iz Mehike, ki so bili zaradi bolj agresivne (Kato et al., 1997) stare seve (US-1), ki so postali dominantni v populacijah. Sprememba sestave evropskih populacij se je zgodila v zelo kratkem času - od 1980 do 1985 (Fry in sod., 1992). Na ozemlju nekdanje ZSSR so v zbirkah iz Estonije leta 1985, torej prej kot na Poljskem in v Nemčiji, našli „nove seve“ (Goodwin in sod., 1994). Zadnjič je bil "stari sev US-1" v Rusiji izoliran iz okuženega paradižnika v Moskovski regiji leta 1993 (Dolgova et al., 1997). Tudi v Franciji so v nasadih paradižnika našli "stare" seve do začetka 90-ih, torej potem, ko so že dolgo izginili na krompirju (Leberton in Andrivon, 1998). Spremembe sevov P. infestans so vplivale na številne lastnosti, vključno z velikimi praktičnimi pomembnostmi, in povečale škodljivost poznega plina.
Spolna rekombinacija
Da bi spolna rekombinacija lahko prispevala k variabilnosti, je najprej potrebno, da sta v populaciji prisotni dve vrsti parjenja v razmerju blizu 1: 1, in drugič, prisotnost začetne variabilnosti populacije.
Razmerje vrst parjenja se zelo razlikuje pri različnih populacijah in celo v različnih letih pri eni populaciji (tabela 9,10, 90). Vzroki za tako drastične spremembe pogostosti vrst parjenja v populacijah (kot na primer v Rusiji ali Izraelu v zgodnjih devetdesetih letih prejšnjega stoletja) niso znani, vendar se domneva, da je to posledica uvedbe bolj konkurenčnih klonov (Cohen, 2002).
Nekateri posredni podatki kažejo na potek spolnega procesa v določenih letih in v nekaterih regijah:
1) Študije populacij iz moskovske regije so pokazale, da je bila pri 13 populacijah, pri katerih je bil delež vrste parjenja A2 manjši od 10%, skupna genetska raznovrstnost, izračunana za tri locije izoencimov, 0,08, pri 14 populacijah, pri katerih je delež A2 presegel 30% je bila genetska raznovrstnost dvakrat večja (0,15) (Elansky in sod., 1999). Torej, večja je verjetnost spolnega odnosa, večja je genska raznolikost populacije.
2) Razmerje med razmerjem tipov parjenja v populacijah in intenzivnostjo tvorbe oospore so opazili v Izraelu (Cohen et al., 1997) in na Nizozemskem
(Flier in sod., 2004). Naše študije so pokazale, da so v populacijah, v katerih so izolati z vrsto parjenja A2 znašali 62, 17, 9 in 6%, oospore našli v 78, 50, 30 in 15% analiziranih listov krompirja (z 2 ali več pegami).
Vzorci z 2 ali več pegami so bistveno pogosteje vsebovali oospore kot vzorci z 1 pego (32 oziroma 14% vzorcev) (Apryshko et al., 2004).
Oospore so bile veliko bolj pogoste v listih srednje in spodnje plasti krompirjeve rastline (Mytsa et al., 2015; Elansky et al., 2016).
3) V nekaterih regijah so odkrili edinstvene genotipe, katerih pojav je povezan s spolno rekombinacijo. Tako so na Poljskem leta 1989 in v Franciji leta 1990 sevi, homozigotni za glukozo-6-
fosfat izomeraza (GPI 90/90). Ker smo prej 10 let srečevali le 90/100 heterozigotov, je homozigotnost pripisana spolni rekombinaciji (Sujkowski et al., 1994). V Kolumbiji (ZDA) so izolati, ki kombinirajo A2 z GPI 100/110 in A1 z GPI 100/100, pogosti, vendar ob koncu sezone 1994 (16. avgusta in 9. septembra) sevi z rekombinantnimi genotipi (A1 GPI 100/110 in A2 GPI 100/100) (Miller et al., 1997).
4) Pri nekaterih populacijah s Poljske (Sujkowski et al., 1994) in Severnega Kavkaza (Amatkhanova et al., 2004) porazdelitev lokusov DNK prstnih odtisov in lokusov alocimov beljakovin ustreza porazdelitvi Hardy-Weinberga, kar kaže na
o visokem deležu prispevka spolne rekombinacije k spremenljivosti populacij. V drugih regijah Rusije niso ugotovili nobenega ujemanja s porazdelitvijo Hardy-Weinberga v populacijah, vendar je bila prisotna neravnovesja v povezavi, kar kaže na prevlado razmnoževanja klonov (Elansky et al., 1999).
5) Genetska raznovrstnost (GST) med sevi z različnimi vrstami parjenja (A1 in A2) je bila manjša kot med različnimi populacijami (Sujkowski et al., 1994), kar posredno kaže na spolne križance.
Hkrati prispevek spolne rekombinacije k raznolikosti prebivalstva ne more biti zelo velik. Ta prispevek je bil izračunan za populacije moskovske regije (Elansky et al., 1999). Po izračunih Lewontina (1979) "rekombinacija, ki lahko ustvari nove različice iz dveh lokusov s frekvenco, ki ne presega zmnožka njihovih heterozigotnosti, postane učinkovita le, če so vrednosti heterozigotnosti za oba alela že visoke".
Z razmerjem obeh vrst seznanjanja, ki je značilno za moskovsko regijo, enako 4: 1, bo frekvenca rekombinacije 0,25. Verjetnost, da bodo križani sevi heterozigotni za dva od treh proučevanih lokusov izocimov v proučevanih populacijah, je bila 0,01 (2 seva od 177). Zato verjetnost pojava dvojnih heterozigotov kot rezultat rekombinacije ne sme presegati njihovega produkta, pomnoženega z verjetnostjo križanja (0,25x0,02x0,02) = 10-4, tj. spolni rekombinanti običajno ne spadajo v preučevani vzorec sevov. Ti izračuni so bili narejeni za populacije iz moskovske regije, za katere je značilna sorazmerno velika variabilnost. V monomorfnih populacijah, kot so sibirske, spolni proces, tudi če se pojavi v posameznih populacijah, ne more vplivati na njihovo gensko raznolikost.
Poleg tega je za P. infestans značilna pogosta neusklajenost kromosomov v mejozi, kar vodi do anevploidije (Carter in sod., 1999). Takšne kršitve zmanjšujejo plodnost hibridov.
Paraseksualna rekombinacija, mitotska pretvorba genov
V eksperimentih na fuziji sevov P. infestans z mutacijami odpornosti na različne zaviralce rasti je bilo ugotovljeno, da se pojavijo mizolati, odporni na oba zaviralca (Shattock in Shaw, 1975; Dyakov, Kuzovnikova, 1974; Kulish, Dyakov,
1979). Sevi, odporni na dva zaviralca rasti, so nastali kot posledica heterokariotizacije micelija in so se v tem primeru cepili med razmnoževanjem z mononuklearnimi zoosporami (Judelson, Ge Yang, 1998) ali v monozoospornih potomcih, ker so imeli tetraploidna (ker so začetni izolati diploidni) jedri (K , 1979). Heterozigotni diploidi so se ločevali zelo nizko pogosto zaradi haploidizacije, nedisunkcije kromosomov in mitotskega križanja (Poedinok et al., 1982). Pogostost teh procesov bi lahko povečali s pomočjo nekaterih učinkov na heterozigotne diploide (na primer UV-obsevanje kalivih spor).
Čeprav se vegetativni hibridi z dvojno odpornostjo pojavljajo ne samo in vitro, temveč tudi v gomoljih krompirja, okuženih z mešanico mutantov (Kulish et al., 1978), je precej težko oceniti vlogo paraseksualne rekombinacije pri ustvarjanju novih genotipov v populacijah. Pogostost nastajanja segregantov zaradi haploidizacije, nedisunkcije kromosomov in mitotskega prehajanja brez posebnih učinkov je zanemarljiva (manj kot 10-3).
Pojav homozigotnih segregantov heterozigotnih sevov lahko temelji na mitotičnem križanju in mitotični genski pretvorbi, ki se pri P. sojae pojavlja s frekvenco 3 x 10-2 do 5 x 10-5 na lokus, odvisno od seva (Chamnanpunt et al. , 2001).
Čeprav se je izkazalo, da je pogostost pojavljanja heterokarionov in heterozigotnih diploidov nepričakovano visoka (doseže desetine odstotkov), se ta postopek zgodi šele, ko se mutirajo kulture, pridobljene iz istega seva. Pri uporabi različnih sevov, izoliranih iz narave, ne pride do heterokariotizacije (ali se zgodi zelo nizko) zaradi prisotnosti vegetativne nezdružljivosti (Poedinok in Dyakov, 1981; Anikina et al., 1997b; Cherepennikova-Anikina et al., 2002). Posledično se lahko vloga paraseksualne rekombinacije zmanjša le na intraklonsko rekombinacijo v heterozigotnih jedrih in prehod posameznih genov v homozigotno stanje brez spolnega procesa. Ta postopek je lahko epidemiološko pomemben pri sevih z recesivnimi ali poldominantnimi mutacijami odpornosti proti fungicidom. Njegov prehod v homozigotno stanje zaradi paraseksualnega procesa bo povečal odpornost nosilca mutacije (Dolgova, Dyakov, 1986).
Introgresija genov
Heterotalne vrste Phytophthora se lahko križajo z nastankom hibridnih oospor (glej Vorob'eva in Gridnev, 1983; Sansome et al., 1991; Veld et al., 1998). Naravni hibrid obeh vrst Phytophthora je bil tako agresiven, da je v Veliki Britaniji ubil na tisoče jelš (Brasier et al., 1999). P. infestans se lahko pojavlja pri drugih vrstah rodu (P. erythroseptica, P. nicotianae, P. Cactorum itd.) Na pogostih gostiteljskih rastlinah in v tleh, vendar je v literaturi malo podatkov o možnosti medvrstnih hibridov. V laboratorijskih pogojih so dobili hibride med P. infestans in P. Mirabilis (Goodwin in Fry, 1994).
Tabela 9. Delež sevov P. infestans z vrsto parjenja A2 v različnih državah sveta v obdobju od 1990 do 2000 (po podatkih odprtih virov literature in spletnih straneh www.euroblight.net, www.eucablight.org)
Država | 1990 | 1991 | 1992 | 1993 | 1994 | 1995 | 1996 | 1997 | 1998 | 1999 | 2000 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Belorusiji | 33 (12) | 34 (29) | |||||||||
Belgiji | 15 (49 *) | 6 (66) | 20 (86) | ||||||||
Ekvador | 0 (13) | 0 (12) | 0 (19) | 0 (21) | 12 (41) | 25 (39) | 15 (75) | 22 (73) | 25 (68) | 0 (35) | |
Estoniji | 8 (12) | ||||||||||
Англия | 4 (26) | 3 (630) | 9 (336) | ||||||||
Finski | 0 (15) | 19 (117) | 12 (16) | 21 (447) | 6 (509) | 9 (432) | 43 (550) | ||||
France | 0 (35) | 0 (56) | 0 (83) | 0 (67) | 0 (86) | 2 (135) | 7 (156) | 6 (123) | 0 (73) | 0 (285) | 0 (135) |
Madžarski | 72 (32) | ||||||||||
Slovenija | 4 (145) | ||||||||||
Sever. Irska | 10 (41) | 9 (58) | 1 (106) | 0 (185) | 0 (18) | 0 (56) | 0 (35) | 0 (26) | |||
Nizozemski | 7 (41) | 5 (276) | 24 (377) | 44 (353) | 23 (185) | ||||||
Норвегия | 25 (446) | 28 (156) | 8 (39) | 18 (257) | 38 (197) | ||||||
Perujem | 0 (34, 1984 -86) | 0 (287, 1997–98) | 0 (112) | 0 (66) | |||||||
Na Poljskem | 19 (180) | 21 (142) | 33 (256) | 26 (149) | 35 (70) | ||||||
Шотландия | 25 (147) | 11 (163) | 22 (189) | 5 (22) | |||||||
Швеция | 25 (263) | 62 (258) | 49 (163) | ||||||||
Wales | 0 (16) | 7 (97) | 0 (48) | 0 (25) | |||||||
Korea | 36 (42) | 10 (130) | 15 (98) | ||||||||
Kitajsko | 20 (142, 1995–98) | 0 (6) | 0 (8) | 0 (35) | |||||||
Kolumbija | 0 (40, 1994–2000) | ||||||||||
Urugvaj | 100 (25, 1998–99) | ||||||||||
Maroko | 60 (108, 1997–2000) | 52 (25) | 42 (40) | ||||||||
Сербия | 76 (37) | ||||||||||
Mehika (Toluca) | 28 (292, 1988–89) | 50 (389, 1997–98) |
Tabela 10. Delež sevov P. infestans z vrsto parjenja A2 v različnih državah sveta v obdobju od 2000 do 2011
Država | 2001 | 2002 | 2003 | 2004 | 2005 | 2006 | 2007 | 2008 | 2009 | 2010 | 2011 |
---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|---|
Avstrija | 65 (83) | ||||||||||
Belorusiji | 42 (78) | ||||||||||
Belgiji | 20 (102 *) | 4 (32) | 50 (14) | 25 (16) | 62 (13) | 54 (26) | 70 (54) | 30 (23) | 29 (35) | 62 (71) | 45 (49) |
Švice | 89 (19) | ||||||||||
Чехия | 35 (31) | 54 (64) | 38 (174) | 12 (80) | |||||||
Nemčiji | 95 (53) | ||||||||||
Danski | 48 (52) | ||||||||||
Ekvador | 5 (178) | 6 (108) | 9 (121) | 18 (94) | 2 (44) | 0 (66) | 5 (47) | ||||
Estoniji | 54 (25) | 0 (24) | 33 (62) | 45 (140) | 25 (100) | 12 (103) | |||||
Англия | 4 (47) | 10 (96) | 31 (55) | 55 (790) | 68 (862) | 70 (552) | 68 (299) | ||||
Finski | 47 (162) | 12 (218) | 42 | ||||||||
France | 0 (186) | 4 (108) | 8 (61) | 22 (103) | 33 (303) | 65 (378) | 74 (331) | 75 (125) | 75 (12) | ||
Madžarski | 48 (27) | 48 (90) | 9 | 7 | |||||||
Sever. Irska | 0 (38) | 0 (58) | 0 (40) | 0 (24) | 5 (54) | 0 (18) | 27 (578) | 45 (239) | 36 (213) | 82 (60) | 10 (80) |
Nizozemski | 66 (24) | 93 (15) | 91 (11) | ||||||||
Норвегия | 39 (328) | 3 (115) | 12 (19) | ||||||||
Perujem | 0 (36) | ||||||||||
Na Poljskem | 25 (46) | 10 (30) | 85 (20) | 38 (44) | 75 (66) | 55 (56) | 65 (35) | 72 (81) | 85 (21) | ||
Шотландия | 3 (213) | 2 (474) | 24 (135) | 86 (337) | 88 (386) | 74 (172) | |||||
Швеция | 60 (277) | 39 (87) | |||||||||
Slovenia | 0 (36) | 14 (26) | 62 (26) | 0 (26) | |||||||
Wales | 25 (12) | 68 (106) | 80 (88) | 92 (143) | 75 (45) | ||||||
Korea | 46 (26) | ||||||||||
Brazil | 0 (49) | 0 (30) | |||||||||
Kitajsko | 10 (30) | 0 (6) | 0 (6) | ||||||||
Vietnam | 0 (294, 2003–04) | ||||||||||
Uganda | 0 (8) |
Dinamika genotipske sestave populacij
Spremembe genotipske sestave populacij P. infestans se lahko pojavijo pod vplivom migracije novih klonov iz drugih regij, kmetijske prakse (sprememba sort, uporaba fungicidov) in vremenskih razmer. Zunanji vplivi vplivajo na različno kloniranje v različnih fazah življenjskega cikla; zato populacije vsako leto doživljajo ciklične spremembe v pogostosti genov, ki so predmet selekcije, zaradi spremembe v prevladujoči vlogi genskega odnašanja in selekcije.
Vpliv sorte
Nove sorte z učinkovitimi geni za vertikalno odpornost (R-geni) so močan selektivni dejavnik, ki v populacijah P. infestans izbere klone z komplementarnimi geni virulence. V odsotnosti nespecifične odpornosti sorte krompirja, ki zavira rast populacije povzročiteljev bolezni, se postopek zamenjave prevladujočih klonov v populaciji zgodi zelo hitro. Tako se je po širjenju v moskovski regiji sorte Domodedovsky, ki ima gen za odpornost R3, pogostost klonov virulentnih za to sorto v enem letu povečala z 0,2 na 0,82 (Dyakov in Derevjagina, 2000).
Vendar se sprememba pogostosti genov virulenc (patotipov) v populacijah zgodi ne le pod vplivom gojenih sort krompirja. Na primer, v Belorusiji so do leta 1977 prevladovali kloni z virulenčnimi genoma 1 in 4, kar je povzročilo gojenje sort krompirja z odpornimi geni R1 in R4 (Dorozhkin, Belskaya, 1979). Konec 70. let 2002. stoletja pa so se pojavili kloni z različnimi virulenčnimi geni in njihovimi kombinacijami, komplementarni odporni geni pa nikoli niso bili uporabljeni pri vzreji krompirja (ekstra virulenčni geni) (Ivanyuk et al., XNUMX). Razlog za pojav takšnih klonov je očitno posledica selitve nalezljive snovi iz Evrope v Mehiko s krompirjevimi gomolji. Doma so se ti kloni razvili ne samo na gojenem krompirju, temveč tudi na divjih vrstah, ki nosijo različne odporne gene, zato je bila kombinacija številnih genov virulence v genomu potrebna za preživetje v teh pogojih.
Kar zadeva sorte z nespecifično odpornostjo, te z zmanjšanjem hitrosti razmnoževanja patogena upočasnijo razvoj njegovih populacij, kar je, kot že omenjeno, funkcija števila. Ker je agresivnost poligenska, se kloni, ki vsebujejo večje število genov za "agresivnost", kopičijo prej, kolikor večja je populacija. Zato zelo agresivne rase niso produkt prilagajanja gojenim sortam z nespecifično odpornostjo, temveč jih je, nasprotno, bolj verjetno zaznati v zasaditvah zelo občutljivih sort, ki so akumulatorji spora parazitov.
Tako so v Rusiji našli najbolj agresivne populacije P. Infestanov na območjih letnih epifitotij (populacije iz Sahalina, Leningrada in Brjanske regije). Izkazalo se je, da je agresivnost teh populacij višja od agresivnosti mehiških (Filippov in sod., 2004).
Poleg tega v listih odpornih sort nastane manj oospor kot pri dovzetnih (Hanson in Shattock, 1998), to pomeni, da nespecifična odpornost sorte zmanjšuje tudi sposobnosti rekombinacije parazita in možnost alternativnih načinov prezimovanja.
Vpliv fungicidov
Fungicidi ne le zmanjšajo število fitopatogenih gliv, tj. vplivajo na kvantitativne značilnosti njihovih populacij, lahko pa spremenijo tudi pogostost posameznih genotipov, tj. vplivajo na kakovostno sestavo populacij. Med najpomembnejšimi kazalniki sprememb populacij pod vplivom fungicidov so naslednji: spremembe odpornosti proti fungicidom, spremembe v agresivnosti in virulenci ter spremembe v reproduktivnih sistemih.
Vpliv fungicidov na odpornost in agresivnost populacij
Stopnjo tega vpliva najprej določa vrsta uporabljenega fungicida, ki ga pogojno lahko razdelimo na polisit, oligosit in monosit.
Prva vključuje večino kontaktnih fungicidov. Odpornost proti njim (če je sploh mogoče) nadzoruje veliko število zelo šibkih ekspresivnih genov. Te lastnosti določajo odsotnost vidnih sprememb odpornosti populacije po njeni obdelavi s fungicidi (čeprav je bilo v nekaterih eksperimentih ugotovljeno povečanje odpornosti). Populacija gliv, ohranjena po pršenju s kontaktnimi fungicidi, je sestavljena iz dveh skupin sevov:
1) sevi, ohranjeni na območjih rastlin, ki niso zdravljene z zdravilom. Ker ni bilo stika s fungicidom, se agresivnost in odpornost teh sevov ne spremeni.
2) Sevi v stiku s fungicidom, katerih koncentracija na stičnih točkah je bila nižja od smrtne. Kot smo že omenili, se odpornost tega dela populacije prav tako ne spreminja, vendar se zaradi delnega škodljivega učinka fungicida tudi v koncentraciji subletala na metabolizem celice glive, splošna sposobnost in njena parazitska komponenta, agresivnost zmanjšuje (Derevyagina in Dyakov, 1990).
Tako ima tudi del populacije, ki ni umrl, izpostavljen stiku s fungicidom, šibko agresivnost in ne more biti vir epifitotikov. Zato je skrbno zdravljenje, ki zmanjšuje pogostost deleža prebivalstva, ki ni v stiku s fungicidom, pogoj za uspeh zaščitnih ukrepov. Odpornost proti oligozitnim fungicidom nadzoruje več aditivnih genov.
Mutacija vsakega gena povzroči določeno povečanje odpornosti, celotna stopnja odpornosti pa je posledica dodajanja takšnih mutacij. Zato se povečanje upora pojavi postopoma. Primer postopnega povečanja odpornosti so mutacije odpornosti proti fungicidu dimetomorf, ki se pogosto uporablja za zaščito krompirja pred pozno cmoto. Odpornost na dimetomorf je poligenska in aditivna. Mutacija v enem koraku nekoliko poveča odpornost.
Vsaka naslednja mutacija zmanjša ciljno velikost in posledično pogostost naslednjih mutacij (Bagirova in sod., 2001). Povečanje povprečne odpornosti populacije po večkratnih obdelavah z oligozitnim fungicidom poteka postopoma in postopoma. Hitrost tega procesa določajo vsaj trije dejavniki: pogostost mutacije odpornih genov, koeficient odpornosti (razmerje smrtnega odmerka odpornega seva glede na občutljivega) in učinek mutacij odpornih genov na sposobnost.
Pogostost pojavljanja vsake naslednje mutacije je nižja od prejšnje, zato ima postopek dušilni značaj (Bagirova in sod., 2001). Če pa se v populaciji pojavijo procesi rekombinacije (spolni ali paraseksualni), je mogoče kombinirati različne mutacije staršev v hibridnem sevu in postopek pospešiti. Zato populacije panmixa pridobijo odpor hitreje kot agamske, pri slednjih pa populacije, ki nimajo vegetativnih ovir za nezdružljivost, hitreje kot populacije, deljene s takšnimi ovirami. V zvezi s tem prisotnost sevov v populacijah, ki se razlikujejo po vrstah parjenja, pospešuje postopek pridobivanja odpornosti proti oligozitnim fungicidom.
Drugi in tretji dejavnik ne prispevata k hitremu kopičenju sevov, odpornih proti dimetomorfom, v populacijah. Vsaka naslednja mutacija približno podvoji odpornost, ki je nepomembna, hkrati pa zmanjša tako hitrost rasti v umetnem okolju kot agresivnost (Bagirova in sod., 2001; Stem, Kirk, 2004). Morda zato naravnih sevov P. infestans praktično ni odpornih sevov, tudi tistih, zbranih iz nasadov krompirja, obdelanih z dimetomorfom.
Populacijo, zdravljeno z oligozitnim fungicidom, bosta sestavljali tudi dve skupini sevov: tisti, ki niso bili v stiku s fungicidom in zato niso spremenili začetnih lastnosti (če med to skupino najdemo odporne seve, se zaradi večje agresivnosti in konkurenčnosti občutljivih sevov ne bodo kopičili), in sevi v stiku s koncentracijami podmrtalnega fungicida. Med slednjimi je mogoče kopičenje odpornih sevov, saj imajo tu prednosti pred občutljivimi.
Zato pri uporabi oligozitnih fungicidov ni pomembna toliko temeljita obdelava kot visoka koncentracija zdravila, nekajkrat večja od smrtne doze, saj je pri postopni mutagenezi začetna odpornost mutiranih sevov majhna.
Nenazadnje so mutacije odpornosti proti monozitnim fungicidom zelo izrazite, to pomeni, da ena mutacija lahko poroča o visoki stopnji odpornosti do popolne izgube občutljivosti. Zato se povečanje odpornosti populacij zgodi zelo hitro.
Primer takih fungicidov so fenilamidi, vključno z najpogostejšim fungicidom, metalaksilom. Mutacije odpornosti nanjo se pojavljajo z visoko frekvenco, stopnja odpornosti mutantov pa je zelo velika - občutljivi sev preseže za tisočkrat ali več (Derevyagina et al., 1993). Čeprav se stopnja rasti in agresivnost odpornih mutantov zmanjšujeta ob odmiranju dovzetnih sevov zaradi sistemskega fungicida, število odporne populacije hitro narašča, hkrati pa narašča tudi njena agresivnost. Zato lahko po nekaj letih uporabe fungicida agresivnost odpornih sevov ne le izenači agresivnost občutljivih, temveč jo tudi preseže (Derevyagina in Dyakov, 1992).
Vpliv na spolno rekombinacijo
Ker je pogost pojav vrste parjenja A2 v populacijah P. infestans sovpadal z intenzivno uporabo metalaksila proti pozni pletvi, se je domnevalo, da metalaksil povzroča pretvorbo tipa parjenja. Pri P. parasitica je bila takšna pretvorba pod delovanjem kloroneba in metalaksila eksperimentalno dokazana (Ko, 1994). En sam prehod na medij z nizko koncentracijo metalaksila je povzročil nastanek homotaličnih izolatov iz seva P. infestans, občutljivega na metalaksil, s tipom parjenja A1 (Savenkova in Cherepnikova-Anikina, 2002). Med nadaljnjimi prehodi na gojiščih z višjo koncentracijo metalaksila ni bil zaznan niti en izolat tipa A2, vendar je večina izolatov ob križanju z izolati A2 namesto oospor tvorila grdo kopičenje micelija in je bila sterilna. Prehodi odpornega seva s tipom parjenja A2 na medijih z visoko koncentracijo metalaksila so nam omogočili, da smo zaznali tri oblike sprememb tipa parjenja: 1) popolno sterilnost pri križanju z izolatoma A1 in A2; 2) homotalizem (tvorba oospor v monokulturi); 3) pretvorba vrste parjenja A2 v A1. Tako lahko metalaksil povzroči spremembe v vrstah parjenja v populacijah P. infestans in posledično pojav spolne rekombinacije v njih.
Učinki na vegetativno rekombinacijo
Nekateri geni za odpornost na antibiotike so povečali pogostnost hipne heterokariotizacije in jedrske diploidizacije (Poedinok in Dyakov, 1981). Kot smo že omenili, se heterokariotizacija hif med fuzijo različnih sevov P. infestans zelo redko pojavi zaradi pojava vegetativne nezdružljivosti te glive. Vendar pa imajo lahko geni za odpornost na nekatere antibiotike neželene učinke, ki se izražajo v premagovanju vegetativne nezdružljivosti. To lastnost je imel 1S-1 mutirani gen za odpornost na streptomicin. Prisotnost takih mutantov v poljskih populacijah fitoftore lahko poveča pretok genov med sevi in pospeši prilagajanje celotne populacije novim sortam ali fungicidom.
Nekateri fungicidi in antibiotiki lahko vplivajo na pogostnost mitotske rekombinacije, kar lahko spremeni tudi pogostost genotipov v populacijah. Široko uporabljani fungicid benomil se veže na beta-tubulin, protein, iz katerega so zgrajene mikrotubule citoskeleta, in s tem moti procese ločevanja kromosomov v anafazi mitoze, kar povečuje pogostnost mitotske rekombinacije (Hastie, 1970).
Fungicid para-fluorofenilalanin, ki se uporablja za zdravljenje nizozemske bolezni pri bezgah, ima enako lastnost. Para-fluorofenilalanin je povečal pogostnost rekombinacije heterozigotnih diploidov P. infestans (Poedinok et al., 1982).
Ciklične spremembe genotipske sestave populacij v življenjskem ciklu P. infestans
Klasični razvojni cikel P. infestans v zmernem pasu je sestavljen iz 4 faz.
1) Faza eksponentne rasti populacije (policiklična faza) s kratkimi generacijami. Ta faza se običajno začne julija in traja 1,5–2 meseca.
2) Faza zaustavitve rasti populacije zaradi močnega zmanjšanja deleža neokrnjenega tkiva ali nastopa neugodnih vremenskih razmer. Ta faza na kmetijah, ki izvajajo zgodnje odstranjevanje listov pred trgatvijo, izpade iz letnega cikla.
3) Faza prezimovanja gomoljev, ki jo spremlja znatno zmanjšanje populacije zaradi nenamerne okužbe gomoljev, počasen razvoj okužbe v njih, odsotnost ponovne okužbe gomoljev, gnitje in odstranjevanje prizadetih gomoljev v običajnih pogojih skladiščenja.
4) Faza počasnega razvoja v tleh in na sadikah (monociklična faza), v kateri lahko trajanje generacije doseže mesec ali več (konec maja - začetek julija). Običajno je v tem času obolele liste težko odkriti, tudi s posebnimi opazovanji.
Faza eksponentne rasti prebivalstva (policiklična faza)
Številna opazovanja (Pshedetskaya, Kozubova, 1969; Borisenok, 1969; Osh, 1969; Dyakov, Suprun, 1984; Rybakova, Dyakov, 1990) so pokazala, da na začetku epifitotije prevladujejo nizko virulentni in rahlo agresivni kloni, ki jih nato nadomestijo bolj virulentni in agresivni. stopnja rasti agresivnosti populacije je večja, manj odporna je sorta gostiteljske rastline.
Z naraščanjem populacije narašča koncentracija tako selektivno pomembnih genov, vnesenih v komercialne sorte (R1-R4) kot selektivno nevtralnih (R5-R11). Tako se je v populacijah blizu Moskve leta 1993 povprečna virulenca od konca julija do sredine avgusta povečala z 8,2 na 9,4, največji porast pa je bil opažen za selektivno nevtralen gen virulence R5 (z 31 na 86% virulentnih klonov) (Smirnov, 1996 ).
Zmanjšanje stopnje rasti populacije spremlja zmanjšanje parazitske aktivnosti populacije. Zato sta v depresivnih letih tako skupno število ras kot delež zelo virulentnih ras nižja kot pri epifitoznih (Borisenok, 1969). Če se na vrhuncu epifitoznih vremenskih razmer spremenijo v neugodne za okužbo s krompirjem in se okužba s krompirjem zmanjša, se zmanjša tudi koncentracija močno virulentnih in agresivnih klonov (Rybakova in sod., 1987).
Povečanje pogostosti genov, ki vplivajo na virulenco in agresivnost populacije, je lahko posledica izbire bolj virulentnih in agresivnih klonov v mešani populaciji. Za prikaz izbora smo razvili metodo za analizo nevtralnih mutacij, ki smo jo uspešno uporabili v kemostatskih populacijah kvasovk (Adams et al., 1985) in Fusarium graminearum (Wiebe et al., 1995).
Pogostost mutantov, odpornih proti blasticidinu S, se je v poljski populaciji P. infestans zmanjšala vzporedno z rastjo agresivnosti populacije, kar kaže na spremembo dominantnih klonov v procesu rasti populacije (Rybakova in sod., 1987).
Faza prezimovanja v gomoljih
Med prezimovanjem v gomoljih krompirja se virulenca in agresivnost sevov P. infestans zmanjšujeta, upadanje virulentnosti pa poteka počasneje kot agresivnost (Rybakova in Dyakov, 1990). Očitno so v razmerah, ki spodbujajo hitro povečanje velikosti populacije (r-selekcija), uporabni "ekstra" virulenčni geni in velika agresivnost, zato razvoj epifitotikov spremlja izbor najbolj virulentnih in agresivnih klonov. V pogojih nasičenosti okolja, ko igra pomembno vlogo ne hitrost razmnoževanja, temveč vztrajanje obstoja v neugodnih razmerah (K-selekcija), "dodatni" geni virulenčnosti in agresivnosti zmanjšajo kondicijo, kloni s temi geni pa prvi odmrejo, tako da povprečna agresivnost virulenca populacije pada.
Faza vegetacije v tleh
Ta faza je najbolj skrivnostna v življenjskem ciklu (Andrivon, 1995). Njegov obstoj je bil domnevan zgolj špekulativno - zaradi pomanjkanja informacij o tem, kaj se s patogenom dogaja v daljšem obdobju (včasih tudi več kot en mesec) - od pojava sadik krompirja do pojava prvih madežev bolezni na njih. Na podlagi opazovanj in poskusov je bilo rekonstruirano vedenje glive v tem življenjskem obdobju (Hirst in Stedman, 1960; Boguslavskaya, Filippov, 1976).
Sporulacija glive lahko nastane na okuženih gomoljih v tleh. Nastale spore kalijo s hifami, ki lahko dlje časa vegetirajo v tleh. Primarne (nastanejo na gomoljih) in sekundarne (na miceliju v tleh) se spore dvigajo na površino zemlje s kapilarnimi tokovi, vendar pridobijo sposobnost okužbe krompirja šele, ko se spodnji listi spustijo in pridejo v stik s površino tal. Takšni listi (namreč na njih najdemo prve pege bolezni) ne nastanejo takoj, temveč po dolgotrajni rasti in razvoju krompirjevih vršičkov.
Tako lahko faza saprotrofne vegetacije obstaja tudi v življenjskem ciklu P. infestans. Če je v parazitski fazi življenjskega cikla agresivnost najpomembnejša sestavina kondicije, je v saprotrofični fazi namenjen zmanjšanju parazitskih lastnosti, kot je eksperimentalno prikazano za nekatere fitopatogene glive (glej Carson, 1993). Zato je treba v tej fazi cikla agresivne lastnosti najbolj intenzivno izgubiti. Toda do zdaj niso bili izvedeni nobeni neposredni poskusi, ki bi potrdili zgornje predpostavke.
Sezonske spremembe vplivajo ne samo na patogene lastnosti P. infestans, temveč tudi na odpornost proti fungicidom, ki raste v policiklični fazi (med epifitotijo) in se zmanjšuje med zimskim skladiščenjem (Derevyagina in sod., 1991; Kadish in Cohen, 1992). Posebno močan padec odpornosti na metalaksil je bil opažen v obdobju med sajenjem prizadetih gomoljev in pojavom prvih madežev bolezni na terenu.
Intraspecifična specializacija in njen razvoj
P. infestans povzroča epidemije dveh komercialno pomembnih poljščin, krompirja in paradižnika. Epifitotije na krompirju so se začele kmalu po vstopu glive na nova območja. Poraz paradižnika so opazili tudi kmalu po pojavu okužbe na krompirju, epifitoze na paradižniku pa so opazili šele sto let kasneje - sredi XNUMX. stoletja. Tukaj pišeta Hallegli in Niederhauser o porazu paradižnika v ZDA
(1962): »Približno 100 let po hudem epifitoznem obdobju 1845 je bilo malo ali skoraj nič poskusov pridobivanja odpornih sort paradižnika. Čeprav je bil pozni ožig na paradižniku prvič zabeležen že leta 1848, je bil rejci na tej rastlini predmet resne pozornosti vse do močnega izbruha bolezni leta 1946. Na ozemlju Rusije je bil paradižnik pozno osip registriran v 60. stoletju. »Dolgo časa raziskovalci niso bili pozorni na to bolezen, saj ni povzročila večje gospodarske škode. Toda v 70. in 1979. letih. Epifitotije poznega plina na paradižniku XX. Stoletja opažamo tudi v Sovjetski zvezi, predvsem v spodnji Volgi, v Ukrajini, na Severnem Kavkazu, v Moldaviji ... «(Balashova, XNUMX)
Od takrat je paradižnikova pegavost s pozno ptico postala enoletna, razširila se je na celotnem ozemlju industrijske in domače pridelave in tej kulturi povzročila ogromno gospodarsko škodo. Kaj se je zgodilo? Zakaj se je prvi pojav parazita na krompirju in epifitozna lezija te kulture zgodil skoraj istočasno, medtem ko je trajalo stoletje, da se je epifitotik pojavil na paradižniku? Te razlike podpirajo mehiški in ne južnoameriški vir okužbe. Če je vrsta Phytophthora infestans nastala kot parazit mehiških gomoljev iz rodu Solanum, je razumljivo, zakaj je bil tako močno prizadet gojeni krompir, ki spada v isti del roda kot mehiška vrsta, vendar zaradi odsotnosti sorazmerja s parazitom, ki ni razvil mehanizmov specifične in nespecifične odpornosti.
Paradižnik pripada drugemu delu rodu, vrsta njegove izmenjave se bistveno razlikuje od gomoljastih vrst, zato kljub dejstvu, da paradižnik ni zunaj prehranske specializacije P. infestans, intenzivnost njegove škode ni bila zadostna za resne gospodarske izgube.
Pojav epifitotij na paradižniku je posledica resnih genskih sprememb parazita, ki so povečale njegovo prilagodljivost (patogenost) ob parazitiranju. Menimo, da je nova oblika, specializirana za parazitiranje paradižnika, rasa T1, ki jo je opisal M. Gallegly, prizadene sorte češnjevega paradižnika (Red Cherry, Ottawa), odporna na raso T0, razširjeno na krompirju (Gallegly, 1952). Očitno mutacija (ali vrsta mutacij), ki je dirko T0 spremenila v dirko T1 in privedla do pojava klonov, zelo prilagojenih porazu paradižnika. Kot se pogosto zgodi, je povečanje patogenosti za enega gostitelja spremljalo zmanjšanje le-tega za drugega, to je, da je nastala začetna, še ne popolna intraspecifična specializacija - za krompir (rasa T0) in paradižnik (rasa T1).
Kateri so dokazi za to predpostavko?
- Pojav na krompirju in paradižniku. Na listih paradižnika prevladuje rasa T1, na listih krompirja pa je redka. Po navedbah S. F. Bagirove in T. A. Orešonkova (neobjavljeno) v Moskovski regiji v letih 1991-1992 je bila pojavnost dirke T1 v nasadih krompirja 0% in v nasadih paradižnika - 100%; v letih 1993-1995 - 33% oziroma 90%; leta 2001 - 0% in 67%. Podobne podatke so dobili v Izraelu (Cohen, 2002). Poskusi okužbe gomoljev krompirja z izolati rase T1 in mešanico izolatov T0 in T1 so pokazali, da so izolati rase T1 v gomoljih slabo ohranjeni in jih nadomestijo izolati rase T0 (Dyakov in sod., 1975; Rybakova, 1988).
2) Dinamika dirke T1 pri zasaditvi paradižnika. Primarno okužbo listov paradižnika izvajajo izolati rase T0, ki prevladujejo pri analizi okužbe na prvih mestih, ki nastanejo na listih. To potrjuje splošno sprejeto shemo selitve parazitov: glavno maso okužbe s krompirjem tvori rasa T0, vendar majhno število klonov T1, ohranjenih v krompirju, enkrat na paradižniku, izpodrine raso T0 in se kopiči proti koncu epifitoznega obdobja. Možno je tudi, da obstaja alternativni vir okužbe listov paradižnika z raso T1, ki ni tako močan kot gomolji in listi krompirja, vendar je stalen. Zato ima ta vir šibek učinek na genetsko strukturo populacije, ki okuži paradižnik, vendar nato določa kopičenje rase T1 (Rybakova, 1988; Dyakov in sod., 1994).
3) Agresivnost do krompirja in paradižnika. Umetna okužba listov paradižnika in krompirja z izolati ras T0 in T1 je pokazala, da so prvi bolj agresivni za krompir kot za paradižnik, drugi pa bolj za paradižnik kot za krompir. Te razlike se kažejo v izpodrivanju izolatov ne-lastne rase iz mešane populacije med prehajanjem listov v rastlinjaku (D'yakov et al., 1975) in na terenih (Leberton et al., 1999); razlike v minimalni nalezljivi obremenitvi, latentnem obdobju, velikosti nalezljivih peg in nastajanju spor (Rybakova, 1988; Dyakov in sod., 1994; Legard in sod., 1995; Forbes in sod., 1997; Oyarzun in sod., 1998; Leberton in sod. al., 1999; Vega-Sanchez et al., 2000; Knapova, Gisi, 2002; Sussuna et al., 2004).
Agresivnost izolatov rase T1 na sorte paradižnika, ki nimajo genov za odpornost, je tako visoka, da se ti izolati sporejo na listih kot na hranilnem mediju, ne da bi okužili tkivo nekrotizirali (Dyakov in sod., 1975; Vega-Sanchez in sod., 2000).
4) Virulenca za krompir in paradižnik. Rasa T1 prizadene sorte češnjevega paradižnika z genom za odpornost Ph1, medtem ko rasa T0 teh sort ne more okužiti, tj. ima ožjo virulenco. V zvezi z diferenciatorji
Geni R krompirja so obratno povezani, tj. sevi, izolirani iz listov paradižnika, so manj virulentni kot sevi "krompirja" (tabela 11).
5) Nevtralni markerji. Analiza nevtralnih markerjev v populacijah P. infestans, ki parazitirajo na krompirju in paradižniku, priča tudi o večsmerni intraspecifični selekciji. V brazilskih populacijah P. infestans so izolati paradižnikovih listov pripadali klonski liniji US-1, tisti iz listov krompirja pa BR-1 (Suassuna et al., 2004). Na Floridi (ZDA) je od leta 1994 na krompirju začel prevladovati klon US-90 (s pojavom več kot 8%), na paradižniku pa kloni US-11 in US-17, izolati slednjih pa so bolj agresivni za paradižnik kot za krompir (Weingartner , Tombolato, 2004). Znatne razlike v pogostosti genotipov (DNA prstni odtisi) v izolatih krompirja in paradižnika so bile ugotovljene za 1200 sevov P. infestans, zbranih v ZDA od leta 1989 do 1995 (Deahl et al., 1995).
Z uporabo metode AFLP je bilo mogoče ločiti 74 sevov, zbranih iz listov krompirja in paradižnika v letih 1996-1997. v Franciji in Švici, v 7 skupinah. Sevi krompirja in paradižnika se očitno niso razlikovali, vendar so bili sevi "krompirja" genetsko bolj raznoliki od "paradižnikov". Prve so našli v vseh sedmih grozdih, druge pa le v štirih, kar kaže na bolj specializiran genom drugih (Knapova in Gisi, 2002).
6) Mehanizmi izolacije. Če se populacije zajedavcev na dveh gostiteljskih rastlinskih vrstah razvijajo proti zožitvi specializacije na svojega »lastnega« gostitelja, potem se pojavijo različni pred- in postmejotični mehanizmi, ki preprečujejo interpopulacijsko gensko izmenjavo (Dyakov in Lekomtseva, 1984).
Številne študije so preučevale vpliv vira staršev na učinkovitost hibridizacije. Pri križanju sevov, izoliranih iz različnih vrst rodu Solanum v Ekvadorju (Oliva in sod., 2002), je bilo ugotovljeno, da so sevi s parjenjem tipa A2 iz divjih Solanaceae (klonska linija EC-2) najslabše križani s sevi iz paradižnika (linija EC -3) in najučinkoviteje križamo s krompirjevim sevom (EC-1).
Ugotovljeno je bilo, da vsi hibridi niso patogeni. Avtorji verjamejo, da sta nizek odstotek hibridizacije in zmanjšanje patogenosti hibridov posledica postmejotičnih mehanizmov reproduktivne izolacije populacij.
V poskusih Bagirove in sod. (1998) je bilo veliko število sevov krompirja in paradižnika križano z lastnostmi ras T0 in T1. Najbolj plodni so bili križanci sevov T1xT1, izolirani iz paradižnika (36 oospor v vidnem polju mikroskopa, 44% kalitve oospore), najmanj učinkoviti pa so bili križanci ras T0xT1, izolirani od različnih gostiteljev (majhno število razvijajočih se in kalivih oospor, velik delež abortivnih in nerazvitih oospor) ... Učinkovitost križanja med izolati rase T0, izoliranimi iz krompirja, je bila vmesna. Ker glavnina sevov rase T0 prizadene krompir, ima zanesljiv vir prezimovanja - gomolje krompirja, zaradi česar je pomen oospor kot prezimovalnih kužnih enot za populacije iz krompirja majhen. Prilagojena "paradižnikova oblika" lahko prezimi na paradižniku v obliki oospor (glej spodaj) in zato ohranja večjo produktivnost spolnega procesa. Zaradi visoke plodnosti T1 pridobi neodvisen potencial za primarno okužbo v paradižniku. Rezultate Knapove in sod. (Knapova in sod., 2002) je mogoče razlagati na enak način. Križi sevov, izoliranih iz krompirja, s sevi iz paradižnika so dali največ oospor - 13,8 na kvadratni mm. srednja (s širitvijo 5-19) in vmesnim odstotkom kalivosti oospor (6,3 s širitvijo 0-24). Prečkanje sevov, izoliranih iz paradižnika, je dalo najnižji odstotek oospor (7,6 s širjenjem 4-12) in najvišji odstotek njihove kalivosti (10,8). Prehodi med sevi, izoliranimi iz krompirja, so dali vmesno število oospor (8,6 z velikim razpršenim podatkom - 0-30) in najnižji odstotek kalivosti oospor (2,7). Tako so sevi krompirja manj rodovitni kot paradižniki, vendar interpopulacijski križi niso dali nič slabših rezultatov kot intrapopulacijski. Možno je, da razlike z zgornjimi podatki Bagirove in sod. pojasnjujejo z dejstvom, da so ruski raziskovalci delali s sevi, izoliranimi v zgodnjih 90-ih letih dvajsetega stoletja, švicarski raziskovalci pa s sevi, izoliranimi v poznih 90-ih.
Osnova za nizko plodnost je lahko heteroploidija sevov. Če je v mehiških populacijah, kjer sta spolni proces in primarna okužba z oospornimi potomci redna, večina preučevanih sevov P. Infestans diploidnih, potem v državah starega sveta opažamo intrapopulacijski polimorfizem ploidnosti (di-, tri- in tetraploidni sevi ter heterokariontski sevi z heteroploidnimi jedri) in sevi z različnimi vrstami parjenja, tj. medsebojno plodni, razlikujejo se po jedrski ploidiji (Therrien et al., 1989, 1990; Whittaker et al., 1992; Ritch, Daggett, 1995). Raznolikost jeder v anteridijah in oogoniji je lahko razlog za nizko plodnost.
Kar zadeva jedrske izmenjave med hifami med anastomozami, to preprečuje vegetativna nezdružljivost, ki razpada nespolne populacije na številne gensko izolirane klone (Poedinok in Dyakov, 1987; Gorbunova in sod., 1989; Anikina in sod., 1997b).
7) Konvergenca populacij. Zgornji podatki kažejo, da je možna hibridizacija med sevi P. krompirja in krompirja P. infestans. Možna je tudi vzajemna ponovna okužba različnih gostiteljev, čeprav z zmanjšano agresivnostjo.
Študija populacijskih označevalcev izolatov s sosednjih polj krompirja in paradižnika leta 1993 je pokazala, da je bila približno četrtina izolatov, izoliranih iz listov paradižnika, prenesena s sosednjega polja krompirja (Dolgova in sod., 1997). Teoretično bi lahko domnevali, da bi se razhajanje populacij na dveh gostiteljih povečalo in povzročilo nastanek specializiranih znotrajvrstnih oblik (f.sp. krompir in f.sp. paradižnik), še posebej, ker lahko oospore ostanejo v rastlinskih ostankih (Drenth et al., 1995 ; Bagirova, Dyakov, 1998) in paradižnikova semena (Rubin et al., 2001). Posledično ima paradižnik trenutno vir spomladanske regeneracije, neodvisen od gomoljev krompirja.
Vendar se je vse zgodilo drugače. Prezimovanje z oosporami je parazitu omogočilo, da se je v svojem življenjskem ciklusu izognil najožji stopnji - monociklični fazi vegetacije v tleh, v kateri se parazitske lastnosti zmanjšujejo, ki se poleti postopno obnavljajo v policiklični fazi.
Tabela 11. Pogostosti genov virulenc za sorte diferenciatorja krompirja pri sevih P. infestans
Država | Leto | Povprečno število virusov genov v sevih | Avtor | |
iz krompirja | iz paradižnika | |||
France | 1995 | 4.4 | 3.3 | Leberton in sod., 1999 |
1996 | 4.8 | 3.6 | Leberton, Andrivon, 1998 | |
Francija, Švica | 1996-97 | 6.8 | 2.9 | Knapova, Gisi, 2002 |
ZDA | 1989-94 | 5 | 4.8 | Goodwin in sod., 1995 |
ZDA, Zap. Washington | 1996 | 4.6 | 5 | Dorrance in sod., 1999 |
1997 | 6.3 | 3.5 | " | |
Ekvador | 1993-95 | 7.1 | 1.3 | Oyarzun in sod., 1998 |
Israel | 1998 | 7 | 4.8 | Cohen, 2002 |
1999 | 6 | 5.7 | " | |
2000 | 6.7 | 6.1 | " | |
Rusija, Mosk. regiji | 1993 | 8.9 | 6.7 | Smirnov, 1996 |
Rusija, različne regije | 1995 | 9.4 | 8 | Kozlovskaya in drugi. |
1997 | 9.2 | 9.2 | " | |
2000 | 8.7 | 4.8 | " |
Primarne zoosporangije in zoospore, ki kalijo oospore, imajo visoko stopnjo parazitske aktivnosti, zlasti če so oospore nastale partenogenetično pod vplivom feromonov seva z nasprotnim tipom parjenja. Zato je kužni material na sadikah paradižnika, pridelanih iz semen, okuženih z oosporami, zelo patogen tako za paradižnik kot za krompir.
Te spremembe so privedle do novega prestrukturiranja prebivalstva, izraženega v naslednjih pomembnih spremembah z epidemiološkega vidika:
- Okužene sadike paradižnika so postale pomemben vir primarne okužbe krompirja (Filippov, Ivanyuk, osebna sporočila).
- Epifitozije krompirja so začeli opazovati že junija, približno mesec prej kot običajno.
- V nasadih krompirja se je povečal odstotek rase T1, ki smo jo tam prej srečali v nepomembni količini (Ulanova in sod., 2003).
- Sevi, izolirani iz listov paradižnika, se niso več razlikovali od sevov krompirja po virulenci na krompirjevih diferenciatorjih virusnih genov in so po agresivnosti presegali seve krompirja ne samo na paradižniku, temveč tudi na krompirju (Lavrova in sod., 2003; Ulanova in sod. , 2003).
Tako je namesto razhajanj prišlo do zbliževanja populacij, pojava ene populacije na dveh gostiteljskih rastlinah z visoko virulenco in agresivnostjo do obeh vrst.
Zaključek
Torej, kljub več kot 150-letnemu intenzivnemu preučevanju P. infestans, v biologiji, vključno s populacijsko biologijo tega povzročitelja najpomembnejših bolezni gojenih rastlin s solnci, ostaja veliko neznanega. Ni jasno, kako prehajanje posameznih stopenj življenjskega cikla vpliva na strukturo populacij, kakšni so genetski mehanizmi kanalizirane variabilnosti agresivnosti in virulentnosti, kakšno je razmerje med reproduktivnim in klonskim sistemom razmnoževanja v naravnih populacijah, kako se deduje vegetativna nezdružljivost, kakšna je vloga krompirja in paradižnika pri primarni okužbi teh pridelkov in pri kakšen je njihov vpliv na strukturo populacij zajedavcev. Zaenkrat še niso rešena tako pomembna praktična vprašanja, kot so genetski mehanizmi za spreminjanje agresivnosti parazita ali erozija nespecifične odpornosti krompirja. Z poglabljanjem in razširitvijo raziskav krompirjevega poznega plina parazit raziskovalcem predstavlja nove izzive. Izboljšanje eksperimentalnih zmogljivosti, pojav novih metodoloških pristopov k manipulaciji z geni in beljakovinami pa nam omogočajo upanje na uspešno rešitev zastavljenih vprašanj.
Članek je bil objavljen v reviji "Zaščita krompirja" (št. 3, 2017)