JEDI. Chudinov, V.A. Platonov, A.V. Aleksandrova, S.N. Elanski
Pred kratkim se je pokazalo, da je gljiva glive ascomycete Ilyonectria crassa sposobna okužiti gomolje krompirja. To delo je prvo za analizo bioloških značilnosti in odpornosti proti nekaterim fungicidom seva I. crassa, izolirane iz krompirja. Zaporedja vrst, značilnih za sev „krompir“, so sovpadala z zaporedji, pridobljenimi prej za glive, izolirane iz korenin narcis, ginsenga, trepetlike in bukve, čebulic lilij in listov tulipanov. Očitno je veliko divjih in vrtnih rastlin lahko rezervat I. crassa. Preiskovani rezini okužili rezine paradižnika in krompirja, niso pa okužili celotnega sadja paradižnika ali nepoškodovanega krompirjevega gomolja. To kaže, da je I. crassa ranski parazit. Ocena odpornosti na fludioksonil, difenokonazol in azoksistrobin na hranilnem mediju je pokazala visoko učinkovitost teh zdravil.
Kazalnik EC50 (koncentracija fungicida, ki upočasni dvakratno hitrost radialne rasti kolonije glede na kontrolo brez fungicidov) je bil enak 2; 0.4 oziroma 7.4 mg / l. Pri fitopatološki presoji gomoljev krompirja in razvoju fitofarmacevtskih ukrepov je treba upoštevati možnost razvoja bolezni, ki jo povzroča I. crassa.
Razvoj fitopatogenih mikroorganizmov povzroči velike izgube v vseh fazah gojenja in skladiščenja krompirja. Pri načrtovanju zaščitnih ukrepov se praviloma upoštevajo znani patogeni, kot so vrste iz rodov Alternaria, Fusarium, Phoma, Helminthosporium, Colletotrichum, Phytophthora itd. V zadnjih letih pa se pojavlja vse več poročil o pojavu novih fitopatogenih mikroorganizmov na krompirju. Njihova biologija je slabo preučena, učinkovitost fungicidov, ki se uporabljajo na krompirju v zvezi z njimi, ni znana, diagnostične metode niso razvite. Z množičnim razvojem lahko pridelku krompirja povzročijo veliko škodo. Eden od teh mikroorganizmov je ascomycete gliva Ilyonectria crassa (Wollenw.) A. Cabral & Crous, ki so jo avtorji prvi odkrili na gomoljih krompirja (Chudinova et al., 2019).
V tem delu so predstavljeni rezultati analize seva I. crassa, izoliranega iz gomoljev krompirja. Preučevali smo morfologijo kolonij in micelijske strukture I. crassa, nukleotidna zaporedja regij DNA specifičnih vrst, virulenco do krompirja in paradižnika ter odpornost na nekatere priljubljene fungicide.
Materiali in metode
Uporabili smo sev I. crassa 18KSuPT2, izoliran leta 2018 iz prizadetega krompirjevega gomolja, gojenega v regiji Kostroma. Gomolj je prizadel suh tip gnilobe z votlino, prekrito s svetlo rjavim micelijem. S sterilno iglo za seciranje smo glivični micelij prenesli v petrijevko z agar medijem (pivska pivina 10%, agar 1.5%, penicilin 1000 U / ml). Plošče smo inkubirali v temi pri 24 ° C.
Za fotografiranje, oceno velikosti in morfologije spor in organov s spori smo uporabili svetlobni mikroskop Leica DM2500 z digitalno kamero ICC50 HD in binokularni mikroskop Leica M80 z digitalno kamero IC80HD (Leica Microsystems, Nemčija).
Za izolacijo DNA smo glivični micelij gojili v tekočem grahovem mediju, nato zamrznili v tekočem dušiku, homogenizirali, inkubirali v CTAB pufru, očistili s kloroformom in dvakrat sprali s 2% alkoholom.
Metoda ekstrakcije DNK je podrobno opisana v članku Kutuzove et al. (2017).
Za določitev vrste z molekularnimi metodami in primerjavo z drugimi znanimi sevi I. crassa smo PCR izvedli s primerji, ki so omogočali amplifikacijo vrst, specifičnih za DNA: ITS1-5,8S-ITS2 (primerji ITS5 / ITS4, White et al., 1990), genske regije b -tubulin (Bt2a / Bt2b, Glass, Donaldson, 1995) in faktor translacijskega raztezanja 1α (tef1α) (primerji EF1-728F / EF1-986R, Carbone in Kohn, 1999). Amplikone želene dolžine smo ekstrahirali iz gela s pomočjo kompleta Evrogen CleanUp. Ojačane regije smo sekvencirali z uporabo kompleta za zaporedje ciklov BigDye® Terminator v3.1 (Applied Biosystems, CA, ZDA) na avtomatiziranem sekvencerju Applied Biosystems 3730 xl (Applied Biosystems, CA, ZDA). Nastala nukleotidna zaporedja so bila uporabljena za iskanje ujemanja v zbirki podatkov GenBank ameriškega nacionalnega centra za biotehnološke informacije (NCBI). Filogenetska analiza je bila izvedena s pomočjo programa MEGA 6 (Tamura in sod., 2013).
Določanje virulence je bilo izvedeno na celih zelenih plodovih velikoplodnega paradižnika (sorta Dubrava) in krompirjevih gomoljih (sorta Gala). Poleg tega smo za simulacijo poškodb poškodovanih plodov in gomoljev uporabili rezine istega sadja in gomoljev. Rezine gomoljev so položili v vlažne komore, ki so bile petrijevke z mokrim filtrirnim papirjem na dnu. Na papir so položili diapozitiv, na katerega so nato položili rezine gomoljev ali sadja. Tudi celi gomolji in sadje so bili položeni v posode z mokrim filtrirnim papirjem na dnu. V sredino rezine (ali na nepoškodovano površino gomolja ali ploda) je bil po 5 dneh gojenja na pivin agar postavljen kos agarja (5 × 5 mm) z glivičnimi hifami.
Ocena odpornosti sevov gliv na fungicide je bila izvedena v laboratorijskih pogojih na hranilnem gojišču agar. Preučevali smo občutljivost na fungicidna zdravila Maxim, KS (učinkovina fludioksonil, 25 g / l), Quadris, KS (azoksistrobin 250 g / l), Scor, EC (difenokonazol 250 g / l) (državni katalog ..., 2020). Ocenjevanje je bilo izvedeno v Petrijevih posodah na gojišča-agar mediju z dodatkom preučevanih zdravil pri koncentracijah učinkovine 0.1; ena; 1 ppm (mg / L) (za fludioksonil in difenokonazol), 10; deset; 1 ppm (za azoksistrobin) in v gojiščih brez fungicida (kontrola). Fugicidu smo dodali stopljeni in ohlajeni medij do 10 ° C, nato pa medij vlili v petrijevke. Blok agarja z glivičnim micelijem smo postavili v sredino Petrijeve posode in v temi gojili pri temperaturi 100 ° C. Po 60 dneh inkubacije so bili premeri kolonij izmerjeni v dveh medsebojno pravokotnih smereh; rezultati meritev za vsako kolonijo so bili povprečeni. Poskusi so bili izvedeni v treh izvodih. Na podlagi rezultatov analiz je bila izračunana EC24, enaka koncentraciji fungicida, ki je prepolovila hitrost radialne rasti kolonije glede na fungicidno kontrolo.
Rezultati in razprava
Na petrijevkah s pivinim agarjem so glive tvorile kolonije z belim flokulentnim micelijem. Gojišče pod micelijem je postalo rdeče-rjave barve. Ko se medij izsuši, gliva na majhnih sporodochia tvori spore dveh vrst na posameznih in združenih konidioforah. Makrokonidije so podolgovate, valjaste, z enim do tremi pregradami, povprečna dolžina 27.2 µm z razponom vrednosti od 23.2 do 32.2 µm, širina - do 4.9 µm (slika 1). Povprečna dolžina mikrokonidije je 14.3 µm z razponom vrednosti od 10.3 do 18.1 µm, širina pa do 4.0 µm. Vsi makro- in mikromorfološki znaki se ujemajo z območjem variacije vrste Ilyonectria crassa (Cabral et al., 2012).
Zaporedja vrst, specifičnih za DNA (ITS, b-tubulin, TEF 1α), so popolnoma sovpadala z zaporedji sevov I. crassa, ki smo jih preučevali prej (Chudinova et al., 2019, tabela 1). Da bi preučili razširjenost I. crassa v drugih regijah in analizirali spekter prizadetih kultur, so analizirali podobna zaporedja DNA v zbirki podatkov GenBank (tabela 1). Prekrivanje je bilo 86 do 100%. Zaporedja vseh treh regij DNA seva I. krompirja "krompir" so bila enaka zaporedjem sevov, izoliranih iz čebulice lilije in korenin narcisa na Nizozemskem in iz korenine ginsenga v Kanadi. V odprtih zbirkah podatkov nismo našli drugih sevov I. crassa s tremi analiziranimi podobnimi zaporedji. Vendar je analiza odloženih zaporedij ITS in b-tubulina pokazala prisotnost I. crassa na listih tulipanov v Združenem kraljestvu. Glive s podobnim zaporedjem ITS so bile ugotovljene pri analizi mikobiote korenin aspen v Kanadi in bukovih korenin v Italiji, gomoljev krompirja v Savdski Arabiji (tabela 1). Rezultati te študije kažejo, da ima I. crassa globalno razširjenost in je sposobna okužiti različne rastlinske vrste.
Pri določanju patogenosti na rezinah paradižnika in krompirja 5. dan je premer lezije dosegel 1.5 cm. Preiskovani sev ni okužil celotnega sadja paradižnika in nepoškodovanega krompirjevega gomolja. Na paradižniku pa so bili prizadeti sepali. Da bi izključili možnost kontaminacije z micelijem, razvitim na rezini krompirjevega gomolja, smo izolirali glive v čisto kulturo. Bil je popolnoma enak starševskemu sevu. Očitno je I. crassa ranski parazit.
Predsajenje semenskih gomoljev s fungicidi zmanjšuje razvoj bolezni na rastlinah v rastni sezoni. Za izbiro učinkovitih fungicidov je pomembno oceniti, kateri izmed njih so učinkoviti proti I. crassa. V delu so preučevali razširjene aktivne snovi fungicidov - fludioksonil, azoksistrobin, difenokonazol. Fludioksonil je vključen v več mešanic, ki se uporabljajo za prelivanje semen in gomoljev semen pred sajenjem. Fludioxonil (Maxim) se uporablja tudi za obdelavo gomoljev semen pred skladiščenjem. Difenokonazol in azoksistrobin sta vključena tudi v številne pripravke, ki se uporabljajo za predelavo semenskega materiala, pa tudi v pripravke, namenjene predelavi vegetativnih rastlin (Državni katalog ..., 2020).
Hitrost rasti I. crassa so preučevali na gojiščih (slika 2) z različnimi koncentracijami aktivnih snovi: fludioksonil (EC50 = 0.4 ppm), azoksistrobin (EC50 = 4 ppm) in difenokonazol (EC50 = 7.4 ppm) (tabela 2). Te pripravke lahko štejemo za zelo učinkovite proti I. crassa, saj je njihov EC50 bistveno nižji od priporočene koncentracije pripravka v delovni tekočini, ki se uporablja za obdelavo gomoljev. Po Državnem katalogu ... (2020) je koncentracija fludioksonila v tekočini za obdelavo gomoljev krompirja od 500 do 1000 ppm, azoksistrobina (v tekočini za obdelavo dna brazde) - 3750-9375 ppm, difenokonazola (v tekočini za obdelavo rastlinskih rastlin) - 187.5– 625 ppm.
Tabela 1. Podobnost zaporedij vrst specifičnih zaporedij seva 18KSuPT2 in sevov Ilyonectria crassa, ki so na voljo v zbirki podatkov Genbank
Obremenitev | Gostiteljska rastlina, mesto izločanja | Številke zaporedja, deponirane v GenBank, odstotek podobnosti | Povezava | ||
ITS | β-tubulin | TEF 1α | |||
17KSPT1 in 18KSuPT2 | Krompirjev gomolj, regija Kostroma | MH818326 | MH822872 | MK281307 | Chudinova et al., 2019, to delo |
CBS 158/31 | Korenine narcisa, Nizozemska | JF735276 100 | JF735394 100 | JF735724 99.3 | Cabral in sod., 2012 |
CBS 139/30 | Lily lukovica, Nizozemska | JF735275 100 | JF735393 99.7 | JF735723 99.3 |
|
NSAC-SH-1 | Koren ginsenga, Kanada | AY295311 99.4 | JF735395 100 | JF735 / 725 99.6 |
|
RHS235138 | List tulipana, Združeno kraljestvo | KJ475469 100 | KJ513266 100 | Nd | Denton, Denton, 2014 |
MT294410 | Korenine Aspen, Kanada | MT294410 100 | Nd | Nd | Ramsfield et al., 2020 |
ER1937 | Bukev, Italija | KR019363 99.65 | Nd | Nd | Tizzani, Haegi, Motta. Neposredna predložitev |
KAUF19 | Krompirjev gomolj, Saudova Arabija | HE649390 98.3 | Nd | Nd | Gashgari, Gherbawy, 2013 |
ND = ni deponirano
Tabela 2. Odpornost Ilyonectria crassa na fungicide
(aktivna snov) | EC50, ppm | ||||
3 dan | 5 dan | 7 dan | |||
Nadzor | 17 2 ± | 33 5 ± | 47 3 ± | ||
Quadris, KS (fsoksistrobin) | 18 1 ± | 34 2 ± | 48 2 ± | ||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
11 1 ± | 11 1 ± | 12 1 ± | |||
Maxim, KS (fludioksonil) | 16 1 ± | 28 2 ± | 48 2 ± | ||
7 1 ± | 13 3 ± | 19 4 ± | |||
5 1 ± | 12 1 ± | 17 5 ± | |||
Škor, ES (difenokonazol) | 18 1 ± | 35 2 ± | 48 1 ± | ||
11 1 ± | 24 3 ± | 35 4 ± | |||
11 1 ± | 13 1 ± | 17 3 ± |
Pri našem delu smo iz gomoljev krompirja v regijah Kostroma in Moskva (Chudinova et al., 2019) izolirali seve I. crassa. Pri analizi mikobiote gomoljev krompirja v Savdski Arabiji je bil razkrit visok delež sevov gliv z zaporedji ITS, enakim I. crassa (Gashgari in Gherbawy, 2013). Očitno I. crassa na krompirju ni tako redka, kot se morda zdi. Naši poskusi so pokazali, da gliva lahko okuži poškodovane plodove paradižnika. Iz literature je znano, da se je I. crassa sposobna razvijati saprotrofno v tleh (Moll in sod., 2016) ter vplivati na različne rastline, tudi taksonomsko oddaljene, kot so narcise, lilije, ginseng, trepetlika in bukev (tabela 1). ena). Očitno je veliko divjih in vrtnih rastlin lahko rezervat I. crassa. Zgornje kaže, da je treba pri razvoju zaščitnih ukrepov upoštevati možnost, da s to glivico prizadenemo gomolje krompirja. Razširjeni pripravki za zdravljenje krompirjevih gomoljev, ki vsebujejo fludioksonil, azoksistrobin in difenokonazol, so pokazali visoko fungicidno učinkovitost proti I. crassa.
To delo je podprla Ruska fundacija za temeljne raziskave (štipendija št. 20-016-00139).
Članek je bil objavljen v reviji "Bilten o varstvu rastlin", 2020, 103 (3)