D. Yu. Ryazantsev, E. M. Chudinova, L. Yu. Kokaeva, S. N. Elansky, P. N. Balabko, G. L. Belova, S. K. Zavriev
Fitopatogena gliva Colletotrichum coccodes povzroča nevarne bolezni krompirja in paradižnika, znane kot antraknoza in črna pegavost gomoljev. Po morfoloških značilnostih jih je pogosto težko ločiti od bolezni, ki jih povzročajo drugi mikroorganizmi; na zelenih plodovih paradižnika je bolezen lahko asimptomatska in se kaže samo na zrelih rdečih plodovih. Za hitro in natančno diagnozo patogena je na voljo sistem za testiranje PCR v realnem času. Za razvoj testnega sistema smo določili nukleotidno zaporedje gena glicerol trifosfat dehidrogenaze 45 sevov coccodes, izoliranih iz gomoljev krompirja v različnih regijah Rusije.
Na podlagi dobljenih rezultatov in analize podobnih zaporedij drugih vrst, ki so na voljo v zbirki podatkov GenBank, so bili zasnovani za posamezne vrste primerji in sonda za C. coccodes. Za testiranje specifičnosti ustvarjenega testnega sistema je bila izvedena PCR z DNA, izolirano iz čistih kultur 15 različnih vrst parazitskih in saprotrofnih gliv, povezanih z rastlinami paradižnika in krompirja (Fusarium oxysporum, F. verticillium, Phomopsis phaseoli, Alternaria alternata, Helminthosporium solani, Colletotrichum coccodes Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Helminthosporium solani, Phomopsis phaseoli, Neonectria radicicola, Rhizoctonia solani, Penicillium sp., Cladosporium fulvum, C. cladosporioides). Prisotnost DNA Colletotrichum coccodes je bila določena pri pragovnem ciklusu 20–27, medtem ko so druge vrste odkrili po 40 ciklih ali pa jih niso odkrili. Testni sistem omogoča zanesljivo zaznavanje koncentracije DNA C. coccodes v 0.01 ng / mm3 v analizirani PCR mešanici. Z uporabo razvitega testnega sistema smo raziskali prisotnost C. coccodes v listih paradižnika s simptomi glivičnih bolezni in v gomoljih krompirja brez zunanjih simptomov bolezni. Listi s simptomi glivične okužbe so bili zbrani z dveh različnih polj v regiji Krasnodar, gomolji - s polj v regijah Kostroma, Moskva, Kaluga in Nižni Novgorod. Na Krasnodarskem ozemlju so našli en list paradižnika, ki vsebuje DNK C. coccodes; v 5 vzorcih gomoljev, gojenih v regijah Kostroma, Moskva in Kaluga, je bila odkrita pomembna prisotnost DNA tega patogena.
Predstavitev
Gobe iz rodu Colletotrichum so nevarni fitopatogeni, ki prizadenejo žita, zelenjavo, zelišča, trajnice sadnih in jagodičja. Ena izmed vseprisotnih vrst tega rodu, Colletotrichum coccodes (Wallr).
Hughes je povzročitelj antrakoze in črne pege krompirja in paradižnika ter povzroča bolezni številnih drugih rastlin družine Solanaceae, vklj. plevela (Dillard, 1992). C. coccodes prizadene vse podzemne dele rastline, stebelne baze, liste in plodove (Andrivon in sod., 1998; Johnson, 1994). Na lupini okuženih gomoljev krompirja opazimo razvoj sivih lis z nejasno izraženimi robovi, na katerih so jasno vidne črne pike sporulacije in mikrosklerocije. Med skladiščenjem lahko v celulozi gomoljev nastanejo razjede z zmehčano vsebino, t.j. bolezen preide v fazo antrakoze, ki pa je izjemno redka.
Hkrati so simptomi antraknoze (razjede na koži z majhnimi črnimi pikami) značilni za plodove paradižnika. Na listih so simptomi C. coccodes videti kot temno rjave lise, običajno obrobljene z rumenim tkivom (Johnson, 1994).
Razvoj črne pege na gomoljih pokvari njihov videz, kar je še posebej izrazito pri prodaji oprane rdeče lupine krompirja. Piling lupine vodi do prekomernega izhlapevanja in povečanih izgub pri skladiščenju (Hunger in McIntyre, 1979). Poškodba drugih rastlinskih organov povzroči izgube pridelka, kar so opazili tako na odprtem kot na zaprtem terenu (Johnson, 1994; Tsror in sod., 1999). Bolezni, ki jih povzročajo C. coccodes, so pogoste v skoraj vseh regijah pridelovalcev krompirja na svetu, vključno z Rusijo (Leesa, Hilton, 2003; Belov et al, 2018). Obvladovanje teh bolezni je težko zaradi nezadostne učinkovitosti obstoječih fungicidov proti C. coccodes in pomanjkanja odpornih sort (Read, Hide, 1995).
Inokulum C. coccodes lahko ostane v gomoljih semen (Read and Hide, 1988; Johnson et al., 1997), paradižnikovih semenih (Ben-Daniel et al., 2010), dolgo preživijo v tleh, na rastlinskih ostankih (Dillard, 1990 ; Dillard, Cobb, 1993) in v plevelih (Raid, Pennypacker, 1987). Dela številnih avtorjev (Read, Hide, 1988; Barkdoll, Davis, 1992; Johnson et al., 1997; Dillard, Cobb, 1993) so pokazala, da je razvoj bolezni pri krompirju in paradižniku v veliki meri odvisen od prisotnosti inokuluma v semenih in prst. Da bi zmanjšali izgube zaradi bolezni, je treba diagnosticirati (vključno s količinsko) razmnoževanje gliv v semenskem materialu, v tleh, v gomoljih semenskega krompirja in paradižnikovem semenu, shranjenih na skladišču. Morfološko diagnostiko v tleh in rastlinskem materialu lahko opravimo le s prisotnostjo mikrosklerocijev, ki pa jih najdemo tudi pri drugih vrstah gliv.
Simptomi na gomoljih so zelo podobni srebrni krasti, ki jo povzroča gliva Helminthosporium solani. Izolacija Colletotrichum coccodes in Helminthosporium solani v čisto kulturo je precej težka in traja dolgo zaradi počasne rasti na hranilnem mediju. Za hitro identifikacijo kokode Colletotrichum je treba uporabiti instrumentalne diagnostične metode. Najbolj priročna metoda je verižna reakcija s polimerazo (PCR) in njeno spreminjanje - PCR v realnem času. Trenutno se v Evropi in ZDA uporablja testni sistem, ki so ga razvili britanski raziskovalci (Cullen et al., 2002) za področje rDNA ITS1. Njegova uporaba je pokazala dobre rezultate pri analizi ruskih izolatov (Belov et al, 2018). Vendar je C. coccodes zelo spremenljiv in njegovo odkrivanje iz enega zaporedja DNA lahko privede do lažno negativnih rezultatov. Za zanesljivejšo diagnozo je potrebna analiza več vrst, specifičnih zaporedij DNA, v zvezi s čimer smo razvili izviren testni sistem, ki omogoča identifikacijo C. coccodes po zaporedju gena gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaze.
Materiali in metode
Za oceno učinkovitosti in specifičnosti ustvarjenih testnih sistemov smo uporabili čiste kulture 15 vrst gliv, ki so jih avtorji izolirali iz prizadetih vzorcev listov in plodov paradižnika, gomoljev krompirja (tabela 1). Za izolacijo so odvzeli organe rastlin s simptomi glivične okužbe, ne več kot en organ na grm.
Rezino gomolja z lupino, rezino paradižnikovega sadja in prizadet list položimo pod binokularni mikroskop, nato pa micelij, spore ali košček tkiva prenesemo na agarjevo gojišče (pivin agar) v Petrijevi posodi z izostreno iglo za seciranje. Izolate smo shranili na poševni agar v epruvetah pri 4 ° C.
Vzorci listov paradižnika s simptomi glivičnih bolezni, namenjeni analizi, so bili takoj po odvzemu (na terenu) dani v 70% etilni alkohol, v katerem so bili shranjeni do izolacije DNA. Krompirjevi gomolji so bili dostavljeni v laboratorij, olupljeni (2 × 1 cm kos) od njih in zamrznjeni pri –20 ° С. Shranjeno zamrznjeno do izolacije DNA.
Čiste kulture gliv za izolacijo DNA smo gojili v tekočem grahovem mediju. Mikelij glive odstranimo iz tekočega medija, posušimo na filtrirnem papirju, zamrznemo v tekočem dušiku, homogeniziramo, inkubiramo v CTAB pufru, očistimo s kloroformom, oborimo z mešanico izopropanola in 0.5 M kalijevega acetata, dvakrat speremo s 2% alkoholom. Nastalo DNA smo raztopili v deionizirani vodi in shranili pri –70 ° С (Kutuzova et al., 20). Koncentracijo DNA smo izmerili s pomočjo HS kvantifikacijskega kompleta za dvoverižno DNA na Qubit 2017 (Qiagen, Nemčija). Alkoholizirani in zamrznjeni vzorci so bili triturirani v tekočem dušiku, nato je bila izvedena ekstrakcija DNA, kot je opisano zgoraj (za micelij čistih glivičnih kultur).
Tabela 1. Izvor uporabljenih sevov gliv
Ime gobe | Rastlina, organ | Kraj izbire |
---|---|---|
Colletotrichum coccodes 1, C. coccodes 2, C. coccodes 3, Ilyonectria crassa, Rhizoctonia solani | krompirjev gomolj | Kostromska regija, gomolji krompirja 1. poljske generacije, sorta Red Scarlett |
4. Colletotrichum coccodes | krompirjev list | Rep. Mari El, Yoshkar-Ola |
Helminthosporium solani | krompirjev gomolj | Regija Magadan, poz. Šotor, krompirjev gomolj |
Cladosporium fulvum | list paradižnika | Moskovska regija, velikoplodni paradižnik |
Alternaria tomatophila | paradižnikovo sadje | predložilo osebje laboratorija za mikologijo in fitopatologijo Vseslovenskega raziskovalnega inštituta za zaščito rastlin |
Fusarium verticillium, Phomopsisphaseoli, Alternaria alternata, Phellinus ferrugineovelutinus, Stemphylium vesicarium, Cladosporium cladosporioides, Acrodontium luzulae, Penicillium sp. | paradižnikovo sadje | Krasnodarsko ozemlje, okrožje Krymsky, razred Cream |
Fusarium oxysporum | korenina pšenice | Moskva |
PCR smo izvedli na ojačevalniku DTprime (DNA-Technology). Za PCR so bili uporabljeni originalni primerji in sonda za vrsto, specifično za regijo glicerol-trifosfat-dehidrogenaznega gena: naprej primer Coc70gdf –TCATGATATCATTTCTCTCACGGCA, reverzni primer Coc280gdr - TACTTGAGCATGTAGGCCTGGGT1. Primerji ojačajo območje 213 bp.
Reakcija je zajela 50 ng celotne DNA (pri analizi listov in gomoljev) in 10 ng (pri analizi DNA čistih kultur gliv). Reakcijsko zmes (35 μl) smo s parafinsko plastjo ločili na dva dela: spodnji (20 μl) je vseboval 2 μl 10-kratnega reakcijskega pufra (750 mM Tris-HCl, pH 8.8; 200 mM (NH4) 2SO4; 25 mM MgCl2; 0.1% Tween- 20), 0.5 mM vsakega deoksinukleotid trifosfata, 7 pmol vsakega primerja in 4 pmol fluorirajoče sonde, ki se lahko hidrolizira; zgornja je vsebovala 1 μl 10 × PCR pufra in 1 U Taq polimeraze.
Ločitev mešanice s parafinom omogoča, da se epruvete dolgo hranijo pri temperaturi 5 ° C in po vročem zagonu PCR po 10-minutnem segrevanju pri temperaturi nad 80 ° C. PCR smo izvedli po naslednjem programu: 94.0 ° C - 90 s (1 cikel); 94.0 ° C - 30 s; 64.0 ° C - 15 s (5 ciklov); 94.0 ° C - 10 s; 64.0 ° C - 15 s (45 ciklov); 10.0 ° C - skladiščenje.
Rezultati in razprava
Genska zaporedja glicerol trifosfat dehidrogenaze so bila določena v 45 sevih, izoliranih iz listov, stebel, gomoljev krompirja in plodov paradižnika (Kutuzova, 2018) v različnih regijah Rusije. Preiskana zaporedja vseh sevov smo razdelili v 2 skupini, ki sta se razlikovali v dveh nukleotidih. Nukleotidna zaporedja predstavnikov obeh skupin pod številkama KY496634 in KY496635 so bila deponirana v GenBank.
Primerji coc70gdf, coc280gdr in na njihovi osnovi zasnovana sonda cocgdz so bili preverjeni s programom BLAST (www.ncbi.nlm.nih.gov/blast) na vseh zaporedjih gena glicerol trifosfat dehidrogenaze vrst iz rodu Colletotrichum in drugih organizmov, ki so na voljo v zbirki podatkov GenBank.
V drugih organizmih, ki bi bili zelo homologni primerjem in sondi, niso našli regij DNA.
Občutljivost testnega sistema smo preverili z vzorci z različnimi koncentracijami DNA C. coccodes DNA, DNA iz krompirjevega lista, okuženega z antraknozo (zbrano leta 2017 v Mari El, sorta Red Scarlett), in lupine gomoljev, prizadetih s črno pegavostjo (zbrani v regiji Kostroma, sorta Red Scarlett, tabela 2). Za potrditev prisotnosti DNA v gomoljih in listih krompirja so iz njih izolirali seve C. coccodes v čiste kulture.
Rezultati analize občutljivosti testnega sistema kažejo, da se lahko z njim uspešno diagnosticira prisotnost DNA C. coccodes v vzorcu, kadar je njegova celotna vsebnost v mešanici PCR večja od 0.05 ng. To je povsem dovolj za odkrivanje, saj ena sklerocija v povprečju vsebuje 0.131 ng, ena spora pa približno 0.04 ng DNA (Cullen et al., 2002). Testni sistem, ki ga je razvila britanska skupina (Cullen et al., 2002), je pokazal podobno občutljivost (prag cikla 34 pri 0.05 ng DNA in 37 pri 0.005 ng).
Analiza naravnih vzorcev, ki vsebujejo C. coccodes, je v vseh primerih omogočila zanesljivo razkriti njegovo prisotnost v vzorcu (tabela 2). Predlagana metoda za izolacijo DNA je bila uporabna tudi za analizo naravnih rastlinskih vzorcev.
Tabela 2. Določitev občutljivosti predlaganega testnega sistema za identifikacijo kokode Colletotrichum za PCR v realnem času
Vzorec | Količina DNK v vzorcu *, ng | Mejni cikel | C. odkrivanje kokodov |
---|---|---|---|
Mycelium Colletotrichum coccodes | 50 | 21.3 | + |
5 | 25.7 | + | |
0.5 | 29,7 | + | |
0.05 | 33.5 | + | |
0.005 | 40 | - | |
0.0005 | 42.8 | - | |
0.00005 | - | ||
Lupine gomolja 1 | 50 | 32 | + |
Lupine gomolja 2 | 50 | 30 | + |
Lupine gomolja 3 | 50 | 31.5 | + |
Krompirjev list | 50 | 29.5 | + |
Opomba. * V mešanici izdelkov PCR.
Specifičnost testnega sistema so testirali na vzorcih DNK, odvzetih iz 15 vrst gliv. Vse seve gliv so avtorji izolirali iz prizadetih in zdravih plodov in listov paradižnika, gomoljev krompirja; iz korenine pšenice smo izolirali en sev (tabela 1). Med vrstami, izoliranimi s površine plodov, obstajajo tudi vrste, ki niso patogene za paradižnik (na primer Phellinus ferrugineovelutinus).
Študije so pokazale, da je bila DNK C. coccodes odkrita pri mejnem ciklusu 20–27, medtem ko drugih vrst gliv po 40. ciklusu niso zaznali ali dali signal, kar lahko pripišemo nespecifičnemu učinku hrupa (tabela 3).
Tabela 3. Preverjanje testnega sistema za različne vrste gob
Ime gobe | Mejni cikel |
Colletotrichum coccodes 1 | 20.9 |
C. kokode 2 | 22.6 |
C. kokode 3 | 23 |
C. kokode 4 | 22 |
Fusarium oxysporum | > 40 |
F. verticalillium | > 40 |
Rhizoctonia solani | > 40 |
Phomopsis phaseoli | > 40 |
Alternaria alternata | > 40 |
A. tomatofila | > 40 |
Helminthosporium solani | > 40 |
Phellinus ferrugineovelutinus | > 40 |
Stemphylium vesicarium | > 40 |
Ilyonectria crassa | > 40 |
Cladosporium cladosporioides | > 40 |
C. fulvum | > 40 |
Acrodontium luzulae | > 40 |
Penicillium sp. | > 40 |
Opomba. * Količina DNA v vseh vzorcih je bila 10 ng.
Razviti testni sistem je bil uporabljen za identifikacijo C. coccodes v vzorcih listov paradižnika s simptomi nekrotrofnih patogenov in gomoljev semenskega krompirja brez vidnih simptomov. Za študijo smo vzeli gomolje semen različnih sort, pridelanih v regijah Kostroma, Moskva, Kaluga in Nižni Novgorod. Prisotnost DNK C. coccodes je bila v vzorcih pomembna, pri analizi katerih prag ni presegel 35. Ta prag je bil izbran na podlagi zanesljive določitve 0.05 ng DNA C. coccodes DNA (prag cikla 33.5, tabela 2) in dejstva, da prag ciklov nad 40, je bila diagnosticirana nespecifična DNA nekaterih drugih vrst gliv. S tem pristopom smo odkrili pomembno prisotnost DNA C. coccodes v 5 vzorcih gomoljev, gojenih v regijah Kostroma, Moskva, Kaluga in v enem listu paradižnika iz okrožja Yeisk v Krasnodarski regiji (tabele 4, 5).
Tabela 4. Odkrivanje kokotov Colletotrichum na gomoljih krompirja *
Številka vzorca | Raznolikost krompirja | Kraj rasti | C. odkrivanje kokodov | Mejni cikel |
---|---|---|---|---|
1 | Rdeča škrlatna | Kostromska regija | + | 35 |
2 | + | 35 | ||
3 | - | 38 | ||
4 | Sante | Moskva | + | 34 |
5 | - | |||
6 | - | 41 | ||
7 | - | 41.8 | ||
8 | + | 30 | ||
9 | Zhukovsky zgodaj | Moskva | - | 40.5 |
10 | - | 40.6 | ||
11 | - | |||
12 | Molly | Kaluga regija. | + | 34.3 |
13 | - | 38.4 | ||
14 | Fantazija | Kaluga regija. | - | |
15 | Gala | Nižni Novgorod regiji. | - | |
16 | - |
Opomba. * Količina DNA v vseh vzorcih je bila 50 ng.
Tabela 5. Odkrivanje kokotov Colletotrichum na listih paradižnika *
Številka vzorca | Kraj rasti | C. odkrivanje kokodov | Mejni cikel |
---|---|---|---|
1 | Krasnodarsko ozemlje, okrožje Krim | - | |
2 | - | ||
3 | - | ||
4 | - | 45 | |
5 | - | ||
6 | - | ||
7 | - | ||
8 | - | ||
9 | Krasnodarska regija, okrožje Yeisk | - | 39.2 |
10 | - | 40.8 | |
11 | - | ||
12 | - | 41.6 | |
13 | - | 40 | |
14 | - | 41 | |
15 | - | 41.9 | |
16 | - | ||
17 | - | ||
18 | - | 40.3 | |
19 | - | ||
20 | - | ||
21 | + | 34.5 | |
22 | - | ||
23 | - |
* Količina DNA v vseh vzorcih je bila 50 ng.
Testni sistem, ki smo ga ustvarili, po občutljivosti in specifičnosti ni slabši od tistega, ki so ga razvili britanski raziskovalci (Cullen et al., 2002), in je primeren za analizo rastlinskih vzorcev. Njegova uporaba za analizo semenskih gomoljev je omogočila identifikacijo DNA C. coccodes v gomoljih brez zunanjih znakov poškodb in uspešno analizo okužbe listov.
Do danes v Rusiji niso opravili nobene analize gomoljev krompirja na okuženost s C. coccodes. Naša prva študija je pokazala, da od 16 preizkušenih semenskih gomoljev, gojenih v različnih regijah Ruske federacije, 5 vsebuje C. coccodes. To kaže, da je črna pega gomoljev krompirja v Rusiji pogosta bolezen krompirja, njena vloga pri zmanjševanju obsega in kakovosti pridelka krompirja pa je podcenjena.
Analiza listov paradižnika je pokazala pomembno prisotnost DNA C. coccodes v enem listu iz okrožja Yeisk na Krasnodarskem ozemlju. Prej so pri preučevanju paradižnikovih polj na jugu Rusije z uporabo britanskega testnega sistema (Cullen et al., 2002) našli liste, ki vsebujejo C. coccodes, na nekaterih poljih pa visok delež listov, okuženih s C. coccodes (Belov et al., 2018). Na Krasnodarskem in Primorskem ozemlju v Moskovski regiji smo našli paradižnikovo sadje, iz katerega smo uspeli izolirati čiste kulture C. coccodes. Možno je, da je C. coccodes na paradižniku v Rusiji veliko bolj razširjen, kot se zdaj verjame, in tudi njegova škodljivost je podcenjena.
Tako se je do danes zbralo dovolj informacij o široki razširjenosti C. coccodes na krompirju in paradižniku.
Za boljše razumevanje vloge te glive pri razvoju bolezni krompirja in paradižnika je potrebno obsežno spremljanje njene razširjenosti v Rusiji, proučevanje vloge okužbe tal in semen ter vloga črne pege pri izgubah med skladiščenjem. Uporaba PCR diagnostike lahko bistveno olajša to delo, hkratna uporaba obeh testnih sistemov pa bo znatno povečala natančnost analize.
To delo je podprla štipendija Ruske znanstvene fundacije št. 18-76-00009.
Članek je bil objavljen v reviji "Mycology and Phytopathology" (letnik 54, št. 1, 2020).