»Metode urejanja genoma ne smemo nasprotovati tradicionalnim metodam selekcije. »To je precej novo orodje,« poudarja vodja laboratorija za odpornost rastlin na stres Vseruski raziskovalni inštitut za kmetijsko biotehnologijo (VNIISB) Vasilij Taranov. – Nekoč so kirurgi delali operacije z nožem, potem so se pojavili skalpeli, nato laserji. Operaciji so postale na voljo popolnoma drugačne možnosti. Genski inženiring torej ponuja orodje, s katerim lahko nekaj vzameš in izboljšaš, vendar ne razveljavi ali nadomesti vsega, kar je bilo prej uporabljeno.”
All-Russian Research Institute of Agricultural Biotechnology (VNIISB) upravlja laboratorij za odpornost rastlin na stres, katerega delo poteka v dveh glavnih smereh: iskanje genov, ki določajo odpornost rastlin na abiotski in biotski stres, in urejanje genoma. gojenih rastlin, da bi povečali njihovo odpornost na stres. Raziskovalno področje znanstvenikov vključuje krompir in zelenjavo odprtega tipa.
Z vodjo laboratorija Vasilijem Taranovim in višjo raziskovalko Marino Lebedevo se pogovarjamo o tem, kakšne so lastnosti in prednosti najnovejših tehnologij, kakšne rezultate lahko dosežejo in za reševanje katerih težav ruskih kmetijskih proizvajalcev jih uporabljajo laboratorijski znanstveniki.
– Danes se veliko govori o tem, da je treba pospešiti izbirni postopek. Menijo, da metoda urejanja genoma to omogoča. To je resnica?
V.T.: Bolj pravilno bi bilo reči, da biotehnološke metode ne pomagajo toliko pospešiti selekcijo, temveč razširiti zmožnosti znanstvenikov. Postopek dela na sorti je še vedno precej dolgotrajen, saj govorimo o rastlinah, ki imajo določen življenjski cikel.
Toda strokovnjaki lahko pridobijo rezultate, ki bi jih bilo izjemno težko (če ne nemogoče) doseči s tradicionalnimi metodami vzreje.
S pomočjo genomskega urejanja lahko namensko vnesemo mutacijo, ki neposredno vpliva na določeno lastnost sorte, preostali del kompleksa gospodarsko vrednih lastnosti pa ohranimo nespremenjen.
M.L.: Predstavljajte si, da želimo v našo gojeno sorto vnesti gen za odpornost iz divjega krompirja s tradicionalnimi metodami žlahtnjenja. Da bi to naredil, vzreditelj izvede vrsto križanj "divjakov" z določenimi kulturnimi linijami. Težava je v tem, da se poleg gena za odpornost na sorto prenesejo tudi vsi drugi »divji« geni, kar je največkrat skrajno nezaželeno. Genski inženiring vam omogoča, da vzamete/spremenite samo en želeni gen.
– Obstaja stališče, da kljub dejstvu, da je metoda urejanja genoma znana že približno 10 let, še ni prinesla opaznih komercialnih rezultatov.
V.T.: To ne drži povsem. Vodilna svetovna rejska podjetja uporabljajo urejanje genoma in tega ne skrivajo. Vendar ne vemo, kaj točno počnejo in kakšne rezultate dosegajo.
Dosežki se ne oglašujejo, ker je dražje dati na trg rastlino, ki je bila obdelana z metodami genskega inženiringa, kot tisto, ki je bila pridobljena na tradicionalen način. In včasih je to preprosto nemogoče storiti.
Hkrati je zelo težko dokazati, da je bilo urejanje genoma uporabljeno za ustvarjanje določene sorte z uporabo obstoječih metod.
Med testom bodo strokovnjaki iskali markersko sekvenco v genomu organizma, če bo prisotna, bodo rastlino prepoznali kot gensko spremenjeno. Toda z genomskim urejanjem se v genom ne vnese ničesar, zato ničesar ni mogoče najti.
Spremembe pogosto ne prizadenejo samo enega gena, ampak točno določeno mesto v genu, dobesedno en nukleotid, eno črko. In preostale milijarde črk ostajajo takšne, kot so bile. Če želite ugotoviti, ali je bila rastlina urejena, morate dejansko prebrati njen celoten genom s pokritostjo, ki je desetkrat višja od standardne, da odpravite napako. Nihče ne bo naredil tako obsežne in zelo drage analize, žlahtnitelj pa lahko vedno reče, da je rastlino pridobil z mutagenezo ali tradicionalno selekcijo.
– M.L.: Urejanje genoma na splošno in še posebej izkušnje z uporabo teh tehnologij na rastlinah je dokaj nova zgodba.
Ne nazadnje zato, ker morate za spremembo funkcije vedeti, kaj točno in kako jo urediti. Rastlinske lastnosti določajo geni, najpogosteje skupek genov, med katerimi je treba izbrati primerne tarče za urejanje. Toda razjasnitev funkcij in regulacije specifičnih genov, ki prispevajo k zanimivim lastnostim, zahteva kompleksne in pogosto dolgotrajne študije. V primerjavi z živalmi in ljudmi lahko rečemo, da marsikaterega molekularnega mehanizma lastnosti rastlin (na primer odpornosti, produktivnosti ipd.) ne poznamo dobro. Hkrati so rastlinski genomi večji in kompleksnejši, kar pa naloge prav nič ne poenostavi. S temeljnimi raziskavami rastlinske biologije pa je veliko že znanega in bolj ko to razumemo, bolj se povečujejo naše možnosti za spreminjanje.
Poleg tega govorimo o metodi, ki omogoča popravljanje določenih lastnosti, ne pa tudi uvajanje novih sort na trg, delo na katerem kljub nekoliko pospeševanju še vedno traja leta.
– Ali biotehnologi urejajo gene? Kako določijo dejansko smer dela (namen urejanja)?
V.T.: Biotehnolog mora sodelovati z uspešnim žlahtniteljem izbranega pridelka in v idealnem primeru vključiti druge specializirane proizvajalce. Žlahtnitelj skupaj s kmeti postavi nalogo, žlahtnitelj pomaga izbrati ustrezne genotipe. Mi pa se posvetujemo z biokemiki in genetiki, razmišljamo, kaj lahko ponudimo na tej podlagi (potrebne lastnosti niso vedno dovolj raziskane z biološkega vidika). Pogledamo, kaj dejansko lahko naredimo, opravimo svojo fazo dela, vrnemo nastalo linijo žlahtnitelju, žlahtnitelj pa prinese rezultat sorti.
- Je urejanje genoma draga tehnologija?
V.T.: Stroški pridobitve rastline so odvisni od pridelka in od tega, ali je nastala rastlina urejena ali transgena.
Če govorimo o opremi, potem bo za podjetje, ki se že ukvarja s pridobivanjem materiala brez virusov in mikrokloniranjem, nakup opreme in reagentov za urejanje genoma stal relativno majhen znesek. Ovira za začetek takšnega dela morda niso prevelike investicije, temveč pomanjkanje usposobljenega kadra. Zelo malo je ljudi, ki lahko prevzamejo in opravijo tako specializirano nalogo.
In če se vrnem k stroškom: tehnološki napredek na tem področju je zelo hiter. Metode urejanja genoma, recimo leta 2012, ko so odkrili CRISPR/Cas9 (tehnologija za urejanje genomov višjih organizmov, ki temelji na imunskem sistemu bakterij), in tiste, ki jih imamo zdaj, se zelo razlikujejo. Učinkovitost poslovanja je iz leta v leto večja, stroški pa nižji.
M.L.: To lahko primerjamo s projektom sekvenciranja človeškega genoma. Prvi človeški genom je mednarodni konzorcij sekvenciral 10 let za 2.7 milijarde dolarjev preprosto zato, ker so bile takšne tehnologije na voljo v 90. letih. Trenutno sekvenciranje celotnega človeškega genoma stane manj kot 1000 dolarjev in traja nekaj dni.
– Pojdiva k pogovoru o vašem laboratoriju, ali je osredotočen na temeljno znanost ali aplikativne raziskave?
V.T.: Trudimo se oboje. Sprva smo dajali prednost temeljnim stvarem, zdaj pa poskušamo naš razvoj uporabiti v praksi.
Trenutno na primer preučujemo mehanizme odpornosti krompirja na virus Y. To je veliko temeljnega dela, a če bo uspešno, bo rezultat zelo zanimiv za izbor odpornih sort.
M.L.: Fundamentalna in uporabna znanost sta tesno povezani, ena brez druge ne more obstajati. Če ne vemo, kako virus sodeluje z rastlino, s katerimi specifičnimi beljakovinami, jih ne bomo mogli spremeniti, da bi rastlina postala odporna.
Raziskave virusa Y izvajamo že od leta 2018 in zdaj se bližamo dejstvu, da bomo v naslednjih nekaj letih dobili formulo za odpornost, v prihodnosti pa potreben praktični rezultat: rastlina krompirja ne bo sintetizirala virusnih beljakovin, ampak bo odporen na virus.
– Ali sodelujete z ruskimi rejskimi podjetji/rejci?
V.T.: Na krompirju sodelujemo z mlado žlahtniteljico Marijo Polyakovo, aktivno komuniciramo s strokovnjaki iz Unije krompirja in vzdržujemo stike z Zveznim raziskovalnim centrom za krompir, imenovanim po. A.G. Lorja. Kar zadeva zelje, sodelujemo z rejci in pridelovalci semen Ruske državne agrarne univerze - Moskovske kmetijske akademije poimenovane po. K.A. Timirjazeva Grigorija in Sokrata Monahosa. In pri tem, kar počnemo na tem področju, nas v celoti vodijo oni.
– In spet o virusih. Marina Valerievna, vaše znanstveno zanimanje ne vključuje samo virusa Y. Leta 2023 ste prejeli štipendijo Ruske znanstvene fundacije za izvedbo raziskave na projektu »Študija viromov gojenega krompirja (Solanum tuberosum L.) z uporabo visoko zmogljivih metod sekvenciranja«. Zakaj je ta tema zanimiva?
M.L.: Krompir v večji meri kot mnoge druge rastline trpi zaradi virusnih bolezni, saj se razmnožuje vegetativno. Virusi se kopičijo v gomoljih in se prenašajo na naslednje generacije, zato virusna obremenitev ves čas narašča. Ko pravijo, da se krompir degenerira, govorimo prav o tem.
Virusi niso inertni sistemi; aktivno sodelujejo tako z gostiteljsko rastlino kot drug z drugim. Obstajajo primeri, ko se rastlina, ki je že bolna z enim specifičnim virusom, ne more okužiti z drugim. In obstajajo virusi, ki rastline ne morejo okužiti sami, ampak delujejo le v sodelovanju z drugimi virusi. Ravno pred kratkim je bilo objavljeno delo, ki opisuje oblike virusov, ki pomagajo rastlinam preživeti sušo. Tako nepričakovan prehod iz parazitizma v mutualizem.
Učinkovitih kemikalij za boj proti virusnim boleznim na krompirju ni. Za izboljšanje njegovega zdravja so bile razvite precej zapletene in, kar je najpomembneje, drage metode: z in vitro kulturo, pridobivanje mikrogomoljev. Toda rezultat traja le nekaj generacij. Če želite najti druge rešitve, morate podrobneje preučiti značilnosti virusov, zato je študija zelo, zelo pomembna.
– GOST 33996-2016 „Semenski krompir. Tehnični pogoji in metode za ugotavljanje kakovosti« je navedenih pet virusov (PVK - X virus krompirja; SBK - virus krompirja S; MVK - virus krompirja M; YBK - virus krompirja Y; VSLK - virus ukrivljenosti listov). krompir) in en viroid (PSTV – potato spindle tuber viroid). Se boste posvetili njim?
M.L.: Cilj mojega projekta je uporaba visoko zmogljivih metod za preučevanje tistih viromov (zbirk virusov), ki so prisotni na krompirju v Rusiji. To je zanimivo tako z vidika, kakšni kompleksi različnih virusov se nahajajo na eni rastlini, kot z vidika razširjenosti teh virusov.
Skupaj je v svetu znanih več kot 50 virusov, ki jih najdemo na krompirju. Tisti, ki so navedeni v GOST, so med najnevarnejšimi, poleg tega pa imajo jasne zunanje znake. Tako je mozaična nekroza pogosta manifestacija okužbe z virusom Y, prisotnost virusa zvijanja listov pa je mogoče določiti z značilno deformacijo listnih plošč.
Vendar pa obstaja veliko virusov, ki se fenotipsko ne manifestirajo, čeprav lahko vplivajo tudi na pridelek. Redko jih odkrijejo, a le zato, ker jih ne iščejo.
Kot primer lahko navedem delo kolegov iz Vseslovenskega raziskovalnega inštituta za varstvo rastlin (VIZR). Leta 2019 so objavili članek o odkritju v Rusiji krompirjevega virusa P. Prej je veljalo, da je bil razširjen izključno v Južni Ameriki.
Vprašanje je, kaj bomo odkrili, če ne bomo gledali »pod svetlobo«, kjer je svetlo, ampak tja, kjer še nismo pogledali.
– Kje boste izvajali svoje raziskave?
M.L.: Po pogojih nepovratnih sredstev bo projekt trajal dve leti. Lansko leto smo sodelovali s kmetijo krompirja v regiji Tula, zbirali material, delali z različnimi sortami in reprodukcijami. Letos bomo šli v druge regije in videli, kateri virusi so tam.
Rezultati študije bodo povzeti leta 2025 in zagotovo bomo o njih povedali ruskim pridelovalcem krompirja.